猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的建立

于　静，劳秀杰，陈彦永，何小江，代　兵，赵阿勇，王晓杜，宋厚辉（浙江农林大学动物科技学院，浙江临安311300）



猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的建立

于静，劳秀杰，陈彦永，何小江，代兵，赵阿勇，王晓杜，宋厚辉
（浙江农林大学动物科技学院，浙江临安311300）

摘要：猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2），是感染猪Sus scrofa domestica的一种单链DNA病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法，对于PCV2感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据PCV2 ORF2基因保守区，设计了荧光定量聚合酶链式反应（PCR）引物，利用SYBR Green作为荧光染料建立了一种定量检测PCV2的PCR方法。结果表明：该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点，每微升的最低检测限低至101拷贝DNA。利用该方法对34份PCV2阳性临床样本进行检测，检测符合率为100%，明显高于普通PCR方法的50.0%。因此，本研究建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法为该疾病的预防和控制提供一种有效的检测工具。图4表4参26

关键词：动物学；猪；猪圆环病毒2型；实时荧光定量PCR

猪圆环病毒2（porcine circovirus 2，PCV2），是最小的DNA病毒，断奶仔猪Sus scrofa domestica多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的主要病原，成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一［1-3］。国内外针对PCV2致病机制、诊断方法以及疫苗研制等方面开展了大量的研究［1, 4］。然而，PCV2依然阻碍着养猪业的发展，主要原因可能是其临床发病与亚临床感染猪群中病毒量的不同，检测过程容易造成漏检，导致错误诊断。因此，发展一种高灵敏度、快速检测PCV2的方法尤为重要。猪圆环病毒（PCV）分为PCV1和PCV2等2种基因型，它们基因组结构相似，均含有ORF1和ORF2等2个主要的开放阅读框。ORF1是引起PCV1和PCV2抗原交叉反应的主要原因，其变异很小，同源性高达85%；而ORF2基因是PCV2的重要抗原基因，编码病毒衣壳蛋白（Cap蛋白）［5］，其变异较大，在两型PCV之间不存在抗原交叉反应，被视为PCV1和PCV2的特异性鉴别抗原［6-8］，并在临床检测中取得了良好的效果。基于ORF2的较大变异，可以设计特异性引物对PCV的2个基因型进行鉴定，已成为PCR方法鉴定PCV2的重要靶基因［9］。基于ORF2的这些优势，本研究也选择ORF2作为鉴定引物设计的首选基因。聚合酶链式反应（PCR）方法简单、方便、快速、敏感，在疾病检测中广泛应用，但其高假阳性和易污染的缺点依然存在。PCV2的抗体检测，敏感性和特异性都比较好，但是价格昂贵，技术要求较高。像多重PCR、巢式PCR等技术，虽然也可以达到很高的灵敏度，但是却不能定量。实时荧光定量PCR方法，不仅操作简便、敏感性高、重复性好、省时和可定量分析等优点，是病毒检测的重要方法。因此，本试验利用实时荧光定量PCR技术构建快速、灵敏检测PCV2的方法，以适应实验室和临床中对PCV2的实时定量检测。

1　材料与方法

1.1材料和临床病料

PCV2，猪蓝耳病毒（PRRSV，lelystad virus），猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）和猪瘟病毒（CSFV，hogcholera virus）等菌株由浙江农林大学动物预防医学与公共卫生实验室保存。19份病灶样品采自杭州国茂生态农业科技开发有限公司（简称：国茂），11份阳性病料和4份阴性对照由杭州检疫中心（杭州国正检测技术有限公司，简称：国正）惠赠。

1.2引物设计与合成

ORF2是PCV2的主要免疫原基因，也是主要用于PCR鉴别的基因［9］。根据GenBank公布的PCV2 ORF2基因序列，应用Primer 5.0软件设计ORF2基因全长克隆、普通PCR以及实时荧光定量PCR引物，并通过BLAST对其特异性进行分析。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列详见表1。

表1　实验中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3阳性质粒的制备与稀释

将扩增的ORF2片段与pZERO-blunt载体连接，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α，提取重组质粒，并进行测序。用紫外分光光度计测定重组质粒的吸光度D（260）和D（280），计算出重组质粒的拷贝数，用EASY Dilution试剂将阳性重组质粒稀释到1010拷贝·μL-1，再进行10倍梯度稀释，以108，107，106，105，104，103，102，101，100拷贝·μL-19个拷贝数梯度作为标准模板，-20℃冻存备用。质粒质量浓度（g·L-1）=D（260）×50（g·L-1）/1 000×准模板释稀释倍数。

拷贝数计算公式：拷贝数（拷贝·μL-1）=质粒浓度（g·μL-1）×阿弗加德罗常数/重组质粒分子量。

1.4实时荧光定量反应条件

实时荧光定量PCR反应采用20 μL体系，其组分如下：SYBRRPremix Ex Taq GC（2×）10 μL，qP1 （10 μmol·L-1）0.4 μL，qP2（10 μmol·L-1）0.4 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，双蒸水7.8 μL，模板1 μL。PCR扩增条件：95℃预变性30 s，按95℃10 s，60℃20 s，72℃30 s，进行40个循环。

1.5标准曲线的建立

以重组质粒为标准品，进行10倍梯度稀释，取108～100拷贝·μL-1质粒为模板，用优化的实时荧光定量PCR体系及程序进行检测，同时设空白对照，每个标准品及空白对照均为3个平行重复。以起始模板拷贝数为x轴，循环阈值（Ct）值为y轴做回归曲线，建立PCV2实时荧光定量PCR检测的标准曲线。

1.6实时荧光定量PCR方法的重复性分析

对不同比例的标准品DNA 104, 103和102拷贝·μL-1进行批间和批内重复性试验。样本有3个平行重复（批内重复），分别进行3次重复（批间重复）。对所得Ct值的平均值、标准差和变异系数进行分析。

1.7敏感性和特异性分析

敏感性分析：以不同梯度标准品为模板，分析最低检出限，比较常规PCR与实时荧光定量PCR的敏感性差别。特异性分析：用所建立的实时荧光定量PCR方法对已知阳性样品猪圆环病毒2（PCV2），猪细小病毒（PPV），猪瘟病毒（CSFV）和猪蓝耳病毒（PRRSV）病毒DNA（或cDNA）进行检测，确定该方法的特异性。

1.8临床样本的检测

对采集的34份临床样品进行检测。用试剂盒提取DNA，用上述建立的方法进行检测。

2　结果与分析

2.1标准质粒的制备

以PCV2 DNA为模板，ORF2全长引物ORF2-F与ORF2-R进行PCR扩增，目的片段大小为702 bp，连接到pZERO-blunt载体上，并用载体上的酶切位点进行双酶切，出现载体片段和目的基因片段大小与预期一致，表明重组质粒构建正确（图1）。测序结果与目的片段序列也完全一致。抽提重组质粒，并梯度稀释为108，107，106，105，104，103，102，101，100拷贝·μL-19个比例的质粒为标准模板。

2.2实时荧光定量PCR标准曲线的建立

以梯度稀释重组质粒为模板进行标准曲线的制作。根据PCV2扩增动力学曲线，系统自动生成标准曲线，拷贝数（x）与循环阈值（Ct）之间的线性关系曲线表达式（图2C）为：Ct=-3.38× lgx + 35.98，其斜率为-3.38，相关系数（R2）为1，表明该标准曲线的线性度较好；PCR的扩增效率为97.6%，且表明实时荧光定量PCR最低检测线为101拷贝·μL-1。扩增曲线平滑（图2A），每个样品之间间隔均匀，阳性样品Ct值均在33以下，阴性对照样品没有扩增，最低检出限为101，因此，可以认为Ct值为33时是阴性样品和阳性样品的临界值，即Ct≤33可判为阳性，Ct＞33判为阴性。溶解曲线分析可以反映扩增产物的正确性，是否有非特异性以及荧光信号是否由引物二聚体造成。本实验溶解曲线（图2B）特征峰单一，Tm值（解链温度）在86℃左右，表明是特异扩增。由此可以证明本研究建立的实时荧光定量PCR检测PCV2方法完全可信，可用于后续实验分析。

2.3实时荧光定量PCR方法的重复性分析

实验重复性是方法稳定性的标志。为了验证本研究建立的实时荧光定量PCR的重复性，我们以不同比例的标准品DNA 104，103和102拷贝·μL-1进行批间重复性试验，3份模板的3次批内（表2）和批间（表3）重复检测的Ct值误差均不到0.5，变异系数均小于2%，结果表明该方法具有较高的重复性。

表2　实时荧光定量PCR方法的批内重复性实验结果Table 2　Repetitive experimental results of intra-assay ofreal-time PCR method

表3　实时荧光定量PCR方法的批间重复性实验结果Table 3 Repetitive experimental results inter-assay of real-time PCR method

2.4特异性分析

PCR扩增易出现假阳性，会造成误检，给生产带来负面效应。因此，我们对本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性进行分析，结果表明（图3）：经实时荧光定量PCR检测，只有PCV2在Ct为18左右出现特异性扩增曲线，而检测的猪细小病毒（PPV），猪瘟病毒（CSFV），猪蓝耳病毒（PRRSV）等样品Ct值均大于33或无扩增，被判定为阴性。以上结果证明：本研究建立的实时荧光定量PCR检测PCV2的方法特异性高，可以用于后续临床样品分析。

图3　特异性实验结果Figure 3　Result of specific analysis

2.5敏感性分析

敏感性对评价检测方法的灵敏性非常重要，因此，我们分析了普通PCR和实时荧光定量PCR这2种方法的敏感性。结果发现：普通PCR有扩增条带的模板浓度为104拷贝·μL-1，而实时荧光定量PCR方法在模板比例为101拷贝·μL-1（图4）时有扩增，也就表明实时荧光定量PCR检测PCV2的敏感性比普通PCR的敏感性高1 000倍。以上结果表明：本研究建立的实时荧光定量PCR检测PCV2的方法敏感性高。

图4　敏感性实验结果Figure 4 Results of sensitivity analysis

2.6临床样本的检测

临床样品检测是技术推广的前提。本研究从杭州周围猪场采集的34份样品，其中阳性病灶样品30份，阴性样品4份，通过检测发现普通PCR检测方法符合率为50.0%，实时荧光定量PCR检测符合率为100%（表4），且带病样品的拷贝数为101～104拷贝·μL-1。以上结果表明：本研究建立的实时荧光定量PCR检测PCV2方法比普通PCR方法灵敏度高，能完全适合猪场疾病的检测，且能够定量分析样品的病毒量。

表4　临床样品检测结果Table 4 Analysis of clinical samples

3　讨论

Ⅱ型猪圆环病毒可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），育肥猪皮炎与肾病综合征（PDNS），增生性坏死性肺炎（PNP），猪呼吸道综合征，怀孕母猪的繁殖障碍、新生仔猪的先天性震颤（CT）和新生仔猪腹泻病等疾病［2, 10-14］。中国很多地方猪养殖场PCV2阳性率高达100%，仔猪死亡率高达30%。目前，对PCV2引起疾病的诊断标准、致病机理以及对病毒本身的防治研究还不清晰［15］。PCV2引起疾病的预防主要通过注射疫苗，但是免疫效果不理想。

PCV2引起疾病的诊断主要采用临床症状、病理剖解和实验室诊断等，这些方法诊断结果准确，但耗时长、工作量大，实际生产中难以推广应用［16］。此外，这些方法对亚临床感染猪的诊断经常会遭遇困难。为了解决这些问题，实验室开展了血清中和实验、ELISA、胶体金试纸和PCR等方法用于检测PCV2［17-21］。研究发现，猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒在检测PCV2中具有成本低、不需要特殊仪器且能满足基层需要的优点［18］，但是操作过程比较繁琐，中间环节可能会带来污染。而琼脂扩散试验和圆环病毒抗体胶体金试纸条检测PCV2的方法，虽然特异性、稳定性、符合率等都很高［17］，但是依然存在较高假阳性问题。近年来，实时荧光定量PCR方法在疾病检测方面的应用，进一步提高了检测的灵敏度，缩短了检测时间。

本研究根据PCV2 ORF2基因设计实时荧光定量PCR引物。ORF2编码病毒的核衣壳蛋白（Cap），该蛋白可引起感染猪产生高含量的抗体，且在2个血清型（PCV1和PCV2）之间无交叉反应性，是检测病毒抗体水平的良好抗原［22］。因此，ORF2也成为PCR鉴别PCV2的重要基因［9］。郭慧娟等［23］根据ORF2设计TaqMan实时荧光定量PCR引物，建立了PCV2检测方法，其灵敏度高达到4.53×102拷贝·μL-1，而曹伟伟等［16］TaqMan实时荧光定量PCR方法的最低检测限度为5.06拷贝·μL-1。而SYBR Green I Realtime PCR检测方法的灵敏度基本在10～100拷贝·μL-1，比普通PCR检测方法检测灵敏度提高100～1 000倍［24-25］。

本研究建立的实时荧光定量PCR检测PCV2的方法能够对处于亚临床状态猪进行检测，可以为该病的治疗抢得宝贵时间。本研究建立的实时荧光定量PCR方法与普通PCR相比，灵敏度提高了1 000倍，和已报道实时荧光定量PCR［16, 23, 25-26］检测PCV2的灵敏度相似。总体来说，实时荧光定量PCR方法检测费用较高，所需仪器和操作环境要求较高。但是，本研究建立的实时荧光定量PCR检测PCV2的方法重复性和特异性高，不会造成错诊，会大大减少因病毒蔓延导致的猪场经济损失。此外，本研究建立的实时荧光定量PCR还可以对PCV2进行准确定量，对感病猪的早期诊断和猪场分类防治管理提供了重要的依据。

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A real-time PCR method for detection of porcine circovirus 2

YU Jing, LAO Xiujie, CHEN Yanyong, HE Xiaojiang, DAI Bing, ZHAO Ayong, WANG Xiaodu, SONG Houhui

（School of Animal Science and Technology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:To develop an accurate and rapid detection method for disease screening and prevention with porcine

circovirus type 2（PCV2）, a single-strand DNA virus that infects pigs, primers targeted to the ORF2 fragment of the PCV2 conserved region were designed.A real time polymerase chain reaction（PCR）method was developed using SYBR Green as a fluorescent dye and serial dilutions of ORF2 recombinant plasmid to construct a standard curve for an absolute quantification.Results showed that the detection limit was obtained with 101

copy DNA per microliter.This method exhibited 1 000 times higher sensitivity than conventional PCR, only specific identification of PCV2, and better repeatability with the less than 2% variation coefficient of intra- or inter-assay experiments.A total of 34 PCV2 positive clinical samples were confirmed using this real time PCR method, demonstrating 100% agreement in comparison with the conventional PCR having only 50% agreement.This real time PCR method could provide a valuable tool for PCV2 prevention and control.［Ch, 4 fig.4 tab.26 ref.］

Key words:zoology; porcine; porcine circovirus 2; real-time PCR

作者简介：于静，讲师，博士，从事畜禽遗传与疾病控制研究。E-mail: yujing_2009@163.com。通信作者：宋厚辉，研究员，博士，从事动物疫病防控和公共卫生研究。E-mail: songhh@zafu.edu.cn

基金项目：浙江省科学技术公益项目（2014C32061）；浙江农林大学人才启动项目（2011FR025，2013FR077）；浙江省自然科学基金资助项目（LQ14C010007）；浙江农林大学大学生科技创新训练计划项目（201301017）；浙江农林大学面上基金项目（2013FK001）

收稿日期：2015-04-19；修回日期：2015-06-22

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.023

中图分类号:S852.3

文献标志码：A

文章编号：2095-0756（2016）02-0357-07