丹参单体IH764-3对马兜铃酸致人肾小管上皮细胞损害的保护机制研究

胡波　范红伟　王燕午　马广骏

050081　石家庄市，中国人民解放军白求恩医务士官学校内科教研室(胡波),门诊部(王燕午);河北省石家庄市第四医院(范红伟);中国人民解放军第260医院医教处(马广骏)



·论著·

丹参单体IH764-3对马兜铃酸致人肾小管上皮细胞损害的保护机制研究

胡波范红伟王燕午马广骏

050081石家庄市，中国人民解放军白求恩医务士官学校内科教研室(胡波),门诊部(王燕午);河北省石家庄市第四医院(范红伟);中国人民解放军第260医院医教处(马广骏)

【摘要】目的探讨丹参单体IH764-3在马兜铃酸(aristolochic acid，AA)导致人肾小管上皮细胞系(HK-C)损害中的保护作用及机制。方法以含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养液培养HK-C细胞72 h。实验分为3大组(8小组)，AA组在培养液中加入浓度为20 mg/L的AA；观察组在培养液中加入浓度为20 mg/L的AA和不同浓度丹参单体IH764-3；对照组培养液中不加AA。培养24、48、72 h后，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各细胞培养液中转化生长因子β1(TGF-β1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)、金属蛋白酶2(MMP-2)；采用MTT法观察HK-C细胞活性，实时荧光定量PCR技术检测凋亡蛋白Caspase-3mRNA的表达情况。结果AA刺激后，诱导TGF-β1、TIMP-1、PAI-1表达增加，MMP-2表达减少(P<0.05)。经丹参单体IH764-3干预后，TGF-β1、TIMP-1、PAI-1表达减少，MMP-2表达增加，其中以IH764-3 80 mg/L效果最佳(P<0.05)。AA组及观察组较对照组HK-C细胞的活性均受到抑制，细胞的凋亡率增加，Caspase-3mRNA表达增高(P<0.05)。观察组较AA组细胞活性明显增高，细胞的凋亡率明显下降，Caspase-3mRNA表达降低，观察组中以丹参单体IH764-3 80 mg/L效果最佳(P<0.05)。结论丹参单体IH764-3可明显提高HK-C细胞抵抗AA导致细胞损伤的能力，保护HK-C细胞，其具体途径可能与抑制TGF-β1、TIMP-1、PAI-1、Caspase-3mRNA，升高MMP-2的表达而发挥作用。

【关键词】丹参单体IH764-3；马兜铃酸；人肾小管上皮细胞；细胞凋亡

马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy，AAN)是一类由关木通等含马兜铃酸的相关中草药所造成的急性或慢性肾小管间质性疾病。AAN呈现不可逆性肾功能损害，往往在数月或1～2年内进展到肾功能衰竭。早期研究发现AAN主要表现为损伤肾小管上皮细胞[1]，近年研究又发现AA还有致肿瘤、肾毒性和致基因突变等作用，从而引起国内外学者的广泛关注[2]。肾脏病理研究结果表明，肾小管上皮细胞的细胞凋亡、转分化、中毒性损伤以及肾间质组织缺血等均可能参与其病变的发生、发展过程[3]。马兜铃酸(aristolochic acid，AA)对肾小管上皮细胞的损伤可导致多种细胞因子，如转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)合成增加，导致MMP-2合成减少，这些因子的平衡失调又促进了肾间质纤维化的形成。丹参单体IH764-3可以降低体外培养的肾小管上皮细胞的TGF-β1、TIMP-1、PAI-1等因子表达，从而对肾小管细胞毒性具有一定的拮抗保护作用，减少细胞凋亡，其具体途径可能是通过降低Caspase-3mRNA的表达而发挥作用。本研究通过检测相关指标的蛋白及基因水平表达的变化，观察丹参单体IH764-3对AA诱导的人肾小管上皮细胞系(HK-C)损伤的保护作用，进一步阐明丹参单体IH764-3在延缓肾间质纤维化中的作用机制及探索其最佳的药物浓度，为丹参单体IH764-3的临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料人肾小管上皮细胞HK-C细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。主要试剂AA、胰酶(Sigma公司)，丹参单体IH764-3(天津血液研究所)，MTT(Amresco公司)，总RNA提取试剂盒(Takara)，逆转录试剂盒和PCR试剂盒(Fermentas中国公司)，胎牛血清(Gibico公司)，DMEM-HamsF-12培养液(Hyclone公司)，二甲基亚砜(DMSO)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及分组:HK-C细胞培养条件为37℃、含体积分数0.05的CO2、湿度100%，DMEM-HamsF-12中(培养液含10%胎牛血清及10 g/L青霉素+链霉素)，实验前24 h更换无血清培养液。实验共分3大组(8小组)，对照组在细胞培养液中不加AA；AA组和观察组均在培养液中加入浓度20 mg/L的AA；观察组在培养液中除了加入浓度为20 mg/L的AA外，还要加入丹参单体IH764-3(终浓度分别为5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L)。每组设5个复孔，各组血清浓度一致。孵育24、48、72 h后分别收集培养液，72 h时收集所培养的细胞，每个实验均反复验证3次。

1.2.2观察肾小管上皮细胞大体形态:可见肾小管上皮细胞呈鹅卵石形状紧密排列，细胞核位于细胞中央且深染。

1.2.3计算各组细胞因子水平：以上3大组(8小组)细胞分别于培养24、48、72 h后，吸取培养液200 μl，离心后取上清液，操作按试剂盒说明书，采用ELISA 法检测TGF-B1、TIMP-1、PAI-1 和MMP-2等指标。按照标准曲线计算各组细胞因子水平。

1.2.4MTT法检测细胞活性:培养液200 μl(含HK-C细胞3×104个)加入96孔板中，置于5%的CO2、37℃温箱孵育，至细胞融合至80%以上时，更换无血清培养液继续培养24 h。AA组及观察组分别加入浓度20 mg/L的AA和不同浓度的丹参单体IH764-3，每组设3个复孔。置于上述实验条件的温箱孵育48 h，分别置于倒置显微镜下观察。于实验终止前4 h，每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μl，继续培养4 h。终止培养时弃去孔内培养液。每孔加入DMSO 150 μl，置摇床上低速振荡10 min，充分溶解结晶物。应用酶联免疫检测仪于波长485 nm处测量各孔的吸光度(A)值。

1.2.5实时荧光定量PCR技术检测Caspase-3基因的表达:取5×106个细胞，加入Trizol提取液1 ml，按其说明书提供的操作步骤提取HK-C细胞的总RNA。取5 μl提取的总RNA，以20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的完整性。用紫外线分光光度计检测总RNA在260 nm和280 nm波长处A值，检测其纯度及浓度。根据逆转录试剂盒和RT-PCR试剂盒使用说明进行逆转录和PCR扩增反应。引物由宝生物工程大连有限公司设计合成。Caspase-3基因上游引物为5′-GCAAACCTCAGGGAAACATT-3′，下游引物为5′-ACCTGGACAACTGGACTTTT-3′，产物大小为214 bp。β-actin引物合成：上游引物为5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA-3′，下游引物为5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAG-3′。PCR反应条件为：94℃预变性5 min、变性30 s，60℃退火1 min，68℃延伸30 s，40个循环。

2结果

2.1细胞的生长状况AA组培养48 h后，在倒置显微镜下见脱落细胞数量明显增加，大量细胞悬浮于培养液中，贴壁细胞结构不完整；观察组培养72 h后，仅部分细胞悬浮于培养液中，尤以丹参单体IH764-3(80 mg/L)组明显。见图1。

2.2丹参单体IH764-3对TGF-β1表达的影响经过AA刺激的HK-C细胞24、48、72 h后，AA组TGF-β1水平显著高于对照组(P<0.05)；观察组(80 mg/L的丹参单体IH 764-3组)，培养24、48、72 h的TGF-β1水平均显著低于AA 诱导组( P<0.05)。其中丹参单体IH764-3对TGF-β1的抑制作用表现在浓度80 mg/L 时效果最佳。见表1。

AA组对照组观察组

图13组细胞生长状况(×400)

表1不同浓度丹参单体IH764-3对TGF-β1的影响

组别TGF-β124h48h72h对照组63.80±20.2680.27±38.2970.97±23.23AA组182.51±43.20*286.36±32.27*176.26±40.97*观察组 5mg/L168.57±33.45*#△246.97±36.35*#△164.82±38.65*#△ 10mg/L154.23±37.89*#△250.56±56.35*#△136.46±33.72*#△ 20mg/L132.64±32.45*#△155.13±30.21*#△124.75±29.47*#△ 40mg/L114.75±29.54*#△105.51±27.85*#△104.72±25.32*#△ 80mg/L98.34±23.46*#96.57±28.67*#80.82±30.26*# 160mg/L116.51±33.04*#△159.23±10.04*#△104.38±15.71*#△

注：与对照组比较，*P<0.05；与AA组比较，#P<0.05；与80 mg/L比较，△P<0.05

2.3丹参单体IH764-3各浓度分对TIPM-1表达的影响AA刺激HK-C细胞24、48、72 h后，AA组TIMP-1水平均显著高于对照组( P<0.05)，以24 h为最高。细胞培养24、48、72 h各剂量丹参单体IH764-3的TIMP-1水平均显著低于AA组(P<0.05)。其中丹参单体IH764-3对TIMP-1的抑制作用表现在浓度80 mg/L 时效果最佳。见表2。

表2不同浓度丹参单体IH764-3对TIMP-1的影响

组别TIMP-124h48h72h对照组99.18±28.26102.27±34.09113.47±43.78AA组285.42±53.77*236.47±52.95*217.24±60.37*观察组 5mg/L255.67±39.52*#△186.24±66.26*#△178.89±34.72*#△ 10mg/L174.32±47.12*#△157.43±47.92*#△175.47±47.86*#△ 20mg/L152.67±35.86*#△146.34±28.54*#△134.36±28.27*#△ 40mg/L135.32±35.53*#△103.56±28.89*#△109.47±42.82*#△ 80mg/L98.64±23.74*#106.43±35.78*#107.56±37.84*# 160mg/L119.67±33.76*#△155.66±32.03*#△114.46±27.85*#△

注：与对照组比较，*P<0.05；与AA组比较，#P<0.05；与80 mg/L比较，△P<0.05

2.4丹参各组分对PAI-1 表达的影响HK-C细胞经AA刺激24、48、72 h后，PAI-1表达水平在AA组显著高于对照组(P<0.05)，72 h后PAI-1水平开始下降，但仍高于对照组(P<0.05)。各剂量丹参单体IH764-3在不同时间段时的PAI-1水平均较AA组低(P<0.05)，并在24、48、72 h显示出剂量依赖性。其中丹参单体IH764-3对其表达的抑制作用在浓度80 mg/L 时最佳。见表3。

表3不同浓度丹参单体IH764-3对PAI-1的影响

组别PAI-124h48h72h对照组277.68±78.30298.07±54.45306.38±53.43AA组558.67±43.64*476.75±42.67*417.87±82.73*观察组 5mg/L475.63±49.83*#△436.66±57.44*#△418.77±94.38*#△ 10mg/L374.67±37.66*#△397.32±66.32*#△405.04±67.58*#△ 20mg/L352.85±65.16*#△346.00±48.11*#△413.55±98.55*#△ 40mg/L335.66±55.78*#△364.23±87.23*#△339.76±62.42*#△ 80mg/L298.74±68.23*#306.63±65.72*#297.25±83.21*# 160mg/L339.83±63.25*#△355.64±82.54*#△348.43±68.35*#△

注：与对照组比较，*P<0.05；与AA组比较，#P<0.05；与80 mg/L比较，△P<0.05

2.5丹参单体IH764-3对MMP-2 表达的影响AA 刺激HK-C细胞24、48、72 h后，AA组MMP-2水平较对照组降低( P<0. 05)；80 mg/L的丹参单体IH764-3组，培养24、48、72 h的MMP-2水平均显著高于AA 诱导组(P<0.05)。其中丹参单体IH764-3对MMP-2的促进作用表现在浓度80 mg/L时效果最佳。见表4。

表4不同浓度的丹参单体IH764-3对MMP-2的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与AA组比较，#P<0.05；与80 mg/L比较，△P<0.05

2.6Caspase-3mRNA表达AA组及观察组与对照组比较，Caspase-3mRNA表达明显增高，但与AA组比较，观察组Caspase-3mRNA表达均有所降低(P<0.05)，观察组中不同剂量间比较，以丹参单体IH764-3(80 mg/L)组降低最明显(P<0.05)。见图2。

M12345678

图2Caspase-3mRNA表达

注:M代表内参,1代表对照组,2代表AA组，3～8代表观察组的5～160 mg计量组

3讨论

1993年比利时Vanherweghem“首次”发现并提出Chinese Herbs Nephropathy(CHN，中草药肾病)。随后全世界间或有此类事件报道，引起了国内外中医药和肾脏病学术界的广泛关注。中草药肾病的病理表现主要为长期服用中草药引起肾间质慢性纤维化，由此导致肾小球硬化，而出现慢性肾功能衰竭的肾病理改变。因中药慢性肾毒性临床发病隐匿，肾损害时间较长，一旦出现临床症状，病变多复杂且肾损害不易恢复。据不完全数字统计，截止至2011年12月，我国44%的慢性肾功能衰竭由糖尿病肾病引起，并最终导致尿毒症[4]。目前我们针对糖尿病肾病的治疗，没有有效的根治方法，需要长期联合服用降糖药物或注射胰岛素加中草药物控制症状，这些药物长期应用，势必会造成一些不可避免的肾脏损伤，一旦出现肾脏损伤，如何及时有效的防止药物导致的肾脏损伤就成为临床亟待解决的问题。我们发现AA所致的肾脏损害病理特点非常具有代表性，大剂量、长时间使用还有AA类药物，会导致肾小管萎缩、间质纤维化发生，由于肌体的代偿机制启动了肾小管非适应性再生修复。非适应性再生修复主要以肾间质细胞增殖和纤维化为主，最终的结果会导致肾间质、肾小管、肾小球纤维化，进而发展到肾衰竭。

肾小球基底膜和ECM主要是由胶原、纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)和蛋白多糖构成，在胶原成分中，最重要的是Ⅳ型胶原[5]。基质金属蛋白酶(MMPs)是主要的ECM降解酶。在正常情况下，MMPs和TIMPs是调节ECM的重要的调控系统之一，在其作用下ECM 生成和降解保持动态平衡。体外试验表明，将鼠肾脏系膜细胞置于高糖介质中培养5 d即有MMPs活性的显著降低[6]。最近，Mclennan等[7]在DM大鼠模型肾组织中也发现MMP-2活性降低43%。TIMPs为MMPs家族的天然抑制因子，二者的相对水平对ECM 降解有重要意义。血糖持续性升高可通过某种机制上调TIMP-1，下调MMP-2表达，破坏MMP-2和TIMP-1的平衡，从而阻碍ECM 降解，导致肾组织结构和功能改变[8]。影响MMPs/TIMPs系统和ECM 降解的另一重要机制是TGF-β表达上调[6]，作为多种代谢和血流动力学因素导致ECM积聚的共同中介，TGF-β被认为是MMPs最重要的调控因子。

我们研究发现，AA对肾小管上皮细胞的毒性作用表现在可使TGF-β1、TIMP-1、PAI-1等细胞因子分泌增多，使MMP-2分泌减少，上述因子表达的改变可以通过自分泌和旁分泌的方式作用于HK-C细胞和肾脏血管，促使肾小管间质出现纤维化病变并呈现不可逆性进展，最终导致肾衰竭。那么，这些因子是如何相互作用而达到损伤肾脏，导致肾脏纤维化的呢，我们通过进一步研究发现它们共同的通道和Caspase-3有关。TGF-β1是诱导肾小管上皮细胞、间质成纤维活性增强及转分化的最关键的促纤维化因子，由单核巨噬细胞及活化的肾固有细胞分泌，可参与肾小管间质病变的各个环节[9]。TIMP-1可不可逆地抑制MMP的活性，从而抑制ECM的降解，在肾脏病变及纤维化过程中发挥重要作用。PA I-1 可通过抑制纤溶酶原的活化从而抑制纤维蛋白的降解。本研究结果显示：与对照组比较，AA组TGF-β1、TIMP-1、PAI-1表达增高，MMP-2表达减少。与AA组比较，观察组TGF-β1、TIMP-1、PAI-1表达下降，MMP-2表达增高，尤其以80 mg/L剂量组更加明显(P<0.05)。本研究初步探讨了丹参单体IH764-3对AA所致的肾小管上皮细胞损伤的保护作用，结果表明，一定浓度的丹参单体IH764-3(80 mg/L)可通过降低TGF-β1、TIMP-1、PAI-1的表达，增加MMP-2的表达而减少细胞外基质堆积，阻止肾小管纤维化。

Caspase-3处于细胞凋亡的共同路径上，是细胞凋亡的关键执行者之一。本实验通过采用RT-PCR技术检测各组细胞中Caspase-3mRNA的表达情况，结果表明：对照组和观察组与AA组比较，Caspase-3mRNA表达及细胞凋亡率均降低，观察组与对照组比较，Caspase-3mRNA表达及细胞凋亡率亦有明显降低，其中尤其以80 mg/L剂量组更加明显(P<0.05)。本研究揭示了丹参单体IH764-3对AA所致的肾小管上皮细胞损伤的影响，结果表明，一定浓度的丹参单体IH764-3(80 mg/L)可通过抑制细胞的凋亡而保护被AA损伤的肾小管上皮细胞，其具体途径可能与通过抑制Caspase-3基因表达而发挥作用。

丹参作为传统的活血化瘀最具代表性的药物已广泛应用于临床多年。传统医学把丹参奉为上品，认为丹参具有“活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神”等功效，王巍巍等[10]研究发现丹参在改善AA引起的肾损伤及抗肾纤维化方面具有多重药理作用, 如抗炎、抗脂质过氧化、抑制细胞增殖、减少胶原合成等,通过多靶点来发挥肾保护作用。孙雪峰等[11]研究亦证实丹参能增加肾血流、有利尿和抗炎作用，可降低血Bun、Scr，调节肾组织局部微循环，改善肾功能，同时具有轻度抑制凝血系统与增强纤溶活性作用，降低血小板粘附和纤维蛋白原，从而保护肾功能。丹参单体(IH764-3)是由中国医学科学院血液病研究所从丹参中分离提取的一种有效单体(相对分子质量为158)，它在抑制胶原蛋白合成、沉积及抗纤维化方面有显著的药理活性，还能明显抑制成纤维细胞和活化的贮脂细胞增殖[12,13]，可通过下调H2O2刺激肝星状细胞FAK水平影响MMP213和TIMP21的表达[14]来抑制肝星状细胞增殖并可促进其凋亡[15]。丹参单体IH 764-3在抑制纤维细胞增殖，减少胶原及纤维蛋白的合成，从而减缓肺和肝纤维化的形成方面具有显著的活性。我们前期研究发现丹参对ECM的降解的有效化学成分与丹参单体IH764-3有非常显著的相关性。丹参单体IH764-3在降解肾组织细胞外基质方面比丹参有更强的生物活性，其作用机制与调节TGF-β1、TIMP-1、PAI-1、MMP-2等因子表达，抑制Caspase-3表达而减少肾小管上皮细胞凋亡，从而进一步实现其抗肾小球纤维化的作用。

相关研究显示，我国糖尿病高危人群约有1.5亿，只有8.7%的普通人群清楚地知道糖尿病是肾病的危险因素，糖尿病肾病患者对于自身的疾病知晓率仅为9.4%。糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一[16，17]，约占终末期肾脏病病因的40%～50%[18]。针对上述严峻情况，我们认为糖尿病肾病治疗的新剂型的研制有广阔的应用前景。在今后的研究中，我们将进一步研究丹参单体IH764-3在保护肾脏、预防肾纤维化等作用的其他靶点，以阐明其在发挥肾脏保护方面的作用机制，为临床开发治疗糖尿病肾病的新剂型提供理论依据。

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The protective effect and action mechanism of Salvia miltiorrhiza monomer-IH764-3 on aristolochic acid induced renal tubular epithelial cell injury

HUBo*,FANHongwei,WANGYanwu,etal.

*DepartmentofInternalMedicine,BethuneMedicalProfessionSergeancySchoolofPLA,Shijiazhuang050081,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effects and action mechanism of Salvia miltiorrhiza monomer-IH764-3 on aristolochic acid(AA) induced renal tubular epithelial cell injury.MethodsThe human renal tubular epithelial cell line-HK-C cells were cultured in DMEM medium with 10% fetal calf serum for 72 hours,which were divided into three large groups (eight small groups):control group,the culture solution without AA；AA group,AA was added into culture solution with final concentration of 20mg/L；observation group,AA and IH764-3 (final concentration of 20mg/L)and different concentrations of Salvia miltiorrhiza monomer-IH764-3.After cultured for 24h, 48h, 72h, the expression levels of transforming growth factor 1 (TGF- β 1),tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP-1), plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1), matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) in culture medium were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) The activity of HK-C cells was measured by MTT assay,and the expression levels of Caspase-3 mRNA were detected by Real-time quantitative PCR.ResultsAfter AA stimulation, the expression levels of TGF- β 1, TIMP-1,PAI-1 were increased, however, the expression levels of MMP-2 were obviously decreased (P<0.05). After intervention by Salvia miltiorrhiza monomer-IH764-3, the expression levels of TGF-β1, TIMP-1 and PAI-1 were decreased, however,the expression levels of MMP-2 were increased, in which the group with IH764-3 80mg/L had the best effects (P<0.05). As compared with that in control group,the activity of HK-C cells in AA group and observation group was decreased, however, cell apoptosis rates were increased,moreover, the expression levels of Caspase-3 mRNA were significantly increased (P<0.05). As compared with that in AA group, the activity of HK-C cells in observation group was obviously increased,however,cell apoptosis rates were decreased, furthermore, the expression levels of Caspase-3 mRNA were significantly decreased (P<0.05),with the best effects in IH764-3 80mg/L group (P<0.05).ConclusionSalvia miltiorrhiza monomer-IH764-3 can obviously enhance the ability of HK-C cells against AA that results in cell damage,thus,which can protect HK-C cells from injury, moreover, its action mechanism may be related with decreasing the expression levels of TGF-β1,TIMP-1,PAI-1 Caspase-3 and increasing the expressions of MMP-2.

【Key words】Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3;aristolochic acid;human renal tubular epithelial cell;cell apoptosis

(收稿日期：2015-10-25)

【中图分类号】R 692.6

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)07-0982-05

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.07.006

项目来源：全军青年培育项目(编号：13QNP187)