饮用水有机提取物对L02细胞增殖及细胞周期的影响*

岑延利， 杨光红*， 桂晓玲， 张爱华， 李传美

(贵州医科大学 公共卫生学院， 贵州 贵阳　550025)



饮用水有机提取物对L02细胞增殖及细胞周期的影响*

岑延利**， 杨光红***， 桂晓玲， 张爱华， 李传美

(贵州医科大学 公共卫生学院， 贵州 贵阳550025)

[摘要]目的： 探讨饮用水有机提取物对人正常肝细胞(L02)的细胞增殖及细胞周期的影响。方法： 体外培养L02细胞，将其分别暴露于培养液(空白对照组)、0.1% DMSO(溶剂对照组)和0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 L/mL固相萃取法提取的饮用水有机提取物(染毒组)中24、48及72 h, 采用MTT法观察L02细胞的增殖情况, 流式细胞仪检测细胞周期的构成比。结果： (1)与溶剂对照组比较，各染毒组细胞活力随着有机提取物浓度的增加及时间的延长而降低，差异有统计学意义(P<0.05)；(2)随染毒剂量的增加，细胞周期中G0/G1期细胞比例逐渐下降，除24 h、48 h 0.312 5 L/mL染毒组外，其余剂量染毒组G0/G1期细胞比例均明显低于溶剂对照组(P<0.05)；S期细胞比例则随有机提取物浓度的增加而上升，除24、48及72 h 0.312 5 L/mL的染毒组外，其余染毒组中S期细胞比例的增加与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；染毒48 h、72 h后，L02细胞中G0/G1期细胞比例低于24 h染毒组(P<0.05)；S期细胞比例则高于24 h染毒组(P<0.05)。结论： 在本研究条件下，饮用水有机提取物可以阻滞L02细胞于S期，抑制细胞的增殖，且呈时间、剂量依赖性。

[关键词]饮用水； 有机提取物； 肝细胞； 细胞增殖； 细胞周期

饮用水源中一般都含有一定浓度的天然有机物，工业废水及城镇生活污水[1]、废气和废渣大量排放到自然水环境中，加之农业生产中农药的大量使用，也会对水体造成了严重污染，影响饮水安全[2]。研究发现，水源有机物污染对人体有致畸、致癌、致突变、生殖毒性及细胞毒性等危害[3-5]。课题组前期的动物实验发现，当地饮用水有机提取物可诱导雄性大鼠精子畸形、雄性激素分泌水平异常，同时可导致染色体断裂、肝脏DNA损伤等[6-9]。本研究萃取G市某地饮用水的有机污染物，对人正常肝细胞系L02细胞进行染毒，观察有机提取物对L02肝细胞的细胞增殖和细胞周期的影响。

1材料与方法

1.1实验细胞、主要试剂及仪器

正常人肝L02细胞，来源于中科院昆明细胞库。MTT细胞增殖检测试剂盒(Solarbio 公司)，细胞周期检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，XAD-2大孔树脂(20-60目，美国Sigma公司)，70%乙醇、甲醇、二氯甲烷(川东化工)，胰蛋白酶(Beyotime 公司)。旋转蒸发仪(RE-3000，上海亚英生化仪器有限公司)，超级酶标仪(Max200， 美国Bio-Tek公司 )，流式细胞仪(FC500，贝克曼库尔特商贸有限公司)。

1.2方法

1.2.1水样采集与有机物提取采集G市某地管网末梢水，采用固相萃取法[10]富集水中有机物，萃取剂为XAD-2树脂，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，水样过柱流速为4倍柱体积/min，过柱完后依次用3倍柱体积的二氧甲烷和甲醇先后洗柱，流速0.1倍柱体积/min，洗脱液经旋转蒸发仪25 ℃减压蒸馏挥干，将已挥干的浓缩提取物用DMSO定容，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2L02细胞培养及染毒剂量确定细胞培养基采用含10%胎牛血清的DMEM，并加入青霉素和链霉素，使其终浓度分别为100 U/mL和100 mg/L。将人肝L02细胞置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。用0.25%胰酶消化液消化细胞并传代，取对数生长期细胞进行实验。根据文献[11]及预实验结果，确定最高染毒剂量为5.000 0 L/mL，向下以2倍组距另设4个染毒剂量组，分别为2.500 0 L/mL、1.250 0 L/mL、0.625 0 L/mL和0.312 5 L/mL，同时设溶剂对照组(0.1%DMSO)和空白对照组(培养液)，处理时点为24 、48及72 h。

1.2.3MTT法检测细胞的增殖情况取对数期生长的细胞，从培养瓶(25 cm2)中移去旧培养液，用PBS缓冲液轻柔漂洗2～3次，加入0.25%的胰蛋白酶1 mL消化，弃消化液后用新鲜培养液重悬，细胞计数后接种于细胞培养板，细胞在37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内贴壁培养24 h。每孔加入染毒培养基100 μL，每组设6个复孔，处理时点为24 h、48 h和72 h。细胞染毒结束后小心吸掉上清液，每孔中加入MTT溶液50 μL (5 g/L)，继续培养4 h。弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL， 室温下平板摇床上摇晃10 min，测定光密度D(490 nm)值，并计算细胞存活率，细胞存活率(%)=实验组D/对照组D×100。重复实验3次。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期细胞染毒结束后，收集各组细胞悬液，2 000 r/min离心5 min，弃去上清液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，用4 ℃预冷的70%乙醇固定2 h，PBS再洗涤3次，加入RNase至终浓度50 mg/L及碘化丙碇(PI)染液至终浓度50 mg/L，37 ℃孵育30 min后，用FC500 型流式细胞仪在 488 nm 波长下检测 DNA 含量，分析细胞在增殖周期中 G 1期、 G 2 期和 S 期的分布。重复3次，计算细胞周期各时相的百分比。

1.3统计学方法

2结果

2.1L02细胞增殖活力

随染毒剂量的增加，L02细胞增殖活力逐渐降低，各染毒组与溶剂对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。随染毒时间延长，L02细胞增殖活力亦逐渐下降，48及72 h染毒组均明显低于24 h染毒组(P<0.05)。见表1。

2.2L02细胞细胞周期

除24和48 h的0.312 5 L/mL染毒组外，其余染毒组L02细胞中G0/G1期细胞比例均随染毒剂量的增加而明显降低 (P<0.05)；除24、48 及72 h的0.312 5 L/mL染毒组外，其余染毒组L02细胞中S期细胞比例均随染毒剂量的增加而明显升高 (P<0.05)。48 和72 h染毒组，L02细胞G0/G1期细胞比例均明显低于24 h染毒组(P<0.05)，而S期细胞比例则明显高于24 h染毒组(P<0.05)。见表2、3、4。

表1　饮用水有机提取物染毒对L02细胞

(1)与同时点溶剂对照组比较，P<0.05

图1　饮用水有机提取物对L02细胞增殖活力的影响Fig.1　Influence of organic extracts from drinking water on L02 cell proliferation

组别L02细胞周期(%)G0/G1SG2/M空白对照组 90.92±1.45 9.04±1.380.11±0.10溶剂对照组 89.75±1.1210.15±1.030.10±0.10有机提取物 0.3125L/mL组84.88±0.0912.38±0.012.74±0.08(1) 0.6250L/mL组83.93±0.77(1)15.66±0.64(1)0.40±0.26(1) 1.2500L/mL组79.46±0.20(1)19.36±0.20(1)1.19±0.04(1) 2.5000L/mL组77.41±1.70(1)20.02±0.55(1)3.57±0.52(1) 5.0000L/mL组74.51±0.15(1)20.75±1.43(1)4.75±1.51(1)

(1)与同细胞周期溶剂对照组比较，P<0.05

表3　饮用水有机提取物染毒48 h时

(1)与同细胞周期溶剂对照组比较，P<0.05

表4　饮用水有机提取物染毒72 h

(1)与溶剂对照组比较，P<0.05

3讨论

图2　饮用水有机提取物不同时间染毒对L02细胞周期变化的影响Fig.2　Changes of L02 cells cycle caused by organic extracts from drinking water during different time

生命体的重要特征是细胞通过分裂来增殖、分化，使个体发育、成熟并繁衍后代。由于MTT比色法可间接反映活细胞的多少，且使用酶标仪操作简便、快速。因此，本研究采用MTT比色法检测饮用水有机提取物对人肝L02细胞体外增殖的影响, 发现不同浓度饮用水有机提取物处理人肝L02细胞24、48及72 h后， 各染毒剂量均能显著降低其增殖水平；从量效关系来看，各个作用时间点L02细胞活力均随染毒剂量的增大而降低，具有剂量依赖性(P<0.05)。从时效关系看，有机提取物染毒48和72 h时L02细胞活力与染毒24 h时相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。 该地饮用水有机提取物染毒浓度为0.312 5 L/mL,染毒时间为24 h时，即可抑制L02细胞的增殖。细胞增殖的抑制通常与细胞周期异常有关。一个细胞周期分为2个阶段：分裂期和间期。分裂期是物质准备和积累阶段，包括：G1期、S期及G2期[12-13]。赵淑华等[14]的研究显示某地饮用水有机提取物染毒后，HL-7702细胞的增殖受抑，且可能与S期阻滞有关。由于各地污染物构成不同，其健康危害效应及可能机制不尽相同。为保障本地方人群健康，本实验萃取饮用水有机污染物，观察其肝细胞毒性，为后续深入研究奠定基础。本地饮用水有机提取物染毒L02后，处理组的细胞周期出现异常， G0/G1期细胞比例明显降低，S期细胞比例则显著增加。S期是细胞周期的关键时点，DNA经过复制后，含量增加一倍，可顺利进入G2期。而本研究中，该地饮用水有机污染物可阻滞细胞周期于S期，从而影响了人肝L02细胞的DNA合成，使其不能顺利进入M期，结果导致细胞周期延长，不能正常分裂，从而抑制细胞增殖。目前，细胞周期调控的核心分子基础是Cyclin、CDK和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)[15]。本实验中细胞周期的阻滞、细胞增殖受抑是否与此有关，有待于进一步深入研究。

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(2015-12-22收稿，2016-02-23修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 赵毅

The Influence on Cell Proliferation and Cell Cycle of L02 Cells Exposed to Organic Extracts from Drinking Water

CEN Yanli， YANG Guanghong， GUI Xiaoling， ZHANG Aihua， LI Chuanmei

(SchoolofPublicHealth,GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550025,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the influence of organic extracts from drinking water on liver cell (L02) proliferation and cell cycle. Methods: The L02 cells was cultivated in vitro: blank control group (culture solution), solvent control group (0.1%DMSO); organic extracts group (The dose of pollutants groups were 0.312 5, 0.625 0, 1.250 0, 2.500 0 and 5.000 0 L/mL samples were extracted by solid phase extraction method). Each group was treated for 24 h, 48 h and 72 h. Cell proliferation was measured by MTT assay. The constituent ratio of cell cycle was detected with flow cytometry. Results: (1) Compared with solvent control group, cell vitality of L02 cells decreased gradually with the increasing of exposure time and concentration of organic extracts. The differences were statistically significant (P<0.05). (2)The proportion of cells in G0/G1 phase decreased gradually with the increasing concentration of organic extracts. Except for 0.312 5 L/mL of pollutants group at 24 h and 48 h, significant differences were found in other exposure groups (P<0.05). The proportion of cell in S phase increased gradually with the increasing concentration of organic extracts. Except for 0.312 5 L/mL at 24 h, 48 h and 72 hr exposure, significant differences existed compared with solvent control group, differences were statistically significant (P<0.05). Compared with 24 h exposure group, exposed groups at 48 h-exposure and 72 h-exposure demonstrated significantly increase in G0/G1phase cell proportion and S phase cell proportion with increasing time (P<0.05). Conclusions: The results of the present paper showed that the organic extracts from drinking water can inhibit cell proliferation and change cell cycle of L02 cells.

[Key words]drinking water; organic extracts; hepatic cells; cell proliferation; cell cycle

[中图分类号]R114

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)03-0294-04

*[基金项目]贵州省科技厅基金[黔科合LH字(2014)7102]； 贵阳市科学技术计划项目[筑科合同(2013103)19号]

**贵州医科大学2013级硕士研究生

***通信作者 E-mail:280446859@qq.com

网络出版时间：2016-03-17网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1029.024.html