长链非编码RNA AK125512在肝癌组织中的表达及其临床意义

蔡杰，林孔英，袁声贤，陶其飞，徐庆国，余建，黄位龙，汪珍光，杨远，林川，周伟平（第二军医大学附属东方肝胆外科医院　肝外三科，上海　200433）



长链非编码RNA AK125512在肝癌组织中的表达及其临床意义

蔡杰，林孔英，袁声贤，陶其飞，徐庆国，余建，黄位龙，汪珍光，杨远，林川，周伟平
（第二军医大学附属东方肝胆外科医院肝外三科，上海200433）

[摘 要]目的 检测长链非编码RNA AK125512在肝癌、癌旁肝组织中的表达情况，探讨其与临床病理指标的关系及作为预测肝癌患者术后预后标记物的潜在价值。方法 从本课题组已完成表达谱芯片（GSE54238）中筛选明显差异表达lncRNA-AK125512，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测lncRNAAK125512在肝癌、癌旁肝组织中的表达；x2检验分析肝癌组织中lncRNA-AK125512表达量与临床病理指标相关性；应用Log-rank检验和COX回归模型分析肝癌组织中lncRNA-AK125512表达量与肝癌患者术后预后的关系。结果 lncRNA-AK125512在肝癌组织中较癌旁肝组织明显低表达（P＜0.0001）；肝癌组织中lncRNA-AK125512的表达水平与Edmondson分级（P=0.022）、肿瘤包膜完整与否（P=0.005）、血AFP（P=0.018）明显相关；肝癌组织中lncRNA-AK125512相对低表达患者肝癌切除术后无瘤生存期（P=0.0041）及总体生存期（P=0.0008）均显著缩短。肝癌组织中lncRNA-AK125512相对低表达是影响肝癌患者术后无瘤生存期（P= 0.037）、总体生存期（P=0.003）的一个独立危险因素。结论 lncRNA-AK125512有望成为预测肝癌患者术后预后的一个新的潜在标记物。

[关键词]长链非编码RNA；癌，肝细胞；实时荧光定量PCR；预后

Expression of long non-coding RNA AK125512 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance

CAI Jie,LIN Kong-ying,YUAN Sheng-xian,TAO Qi-fei,XU Qing-guo,YU Jian,HUANG Wei-long,WANG Zhen-guang,YANG Yuan,LIN Chuan,ZHOU Wei-ping.The Third Department of Hepatic Surgery,Eastern Hepatobiliary Hospital Affiliated to Second Military Medical University,Shanghai 200433,China

Abstract objectiveTo investigate the expression of the long non-coding RNA AK125512 in hepatocellular carcinoma(HCC)and its clinical significance.MethodsFrom the lncRNA microarray(GSE54238)which we completed before,lncRNA-AK125512 was selected because of its obvious expression difference.The realtime fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)was performed to detect the expression difference of lncRNAAK125512 between HCC and its adjacent normal tissue.Then,the correlation between the expression of lncRNA-AK125512 in HCC and the clinicopathological characteristics was analyzed by Chi-square test.What’s more,the potential of lncRNA-AK125512 in predicting the prognosis of patient with HCC after operation was assessed by Log-rank test and Cox’s proportional hazards regression model.ResultsThe expression of lncRNAAK125512 in HCC was markedly lower than that in its adjacent normal tissue(P＜0.0001).Moreover,the expression of lncRNA-AK125512 in HCC was significantly correlated with Edmondson classification(P=0.022),complete tumor capsules(P=0.005),alpha fetoprotein(AFP)serum levels(P=0.018).The patients with lower expression of lncRNA-AK125512 in HCC had a statistically shorter tumor-free survival time and overall survival time(P=0.0041,0.0008).What’s more,the lower expression of lncRNA-AK125512 in HCC was an independent risk factor for the tumor-free survival time(P=0.037)and overall survival time(P=0.003)of patients with HCC after curative hepatectomy.ConclusionlncRNA-AK125512 may be a new prognostic biomarker for hepatocel-lular carcinoma after curative hepatectomy.

Key words long non-coding RNA; hepatocellular carcinoma; real-time fluorescence quantitative PCR(qRTPCR); prognosis

肝癌是世界范围内的高发恶性肿瘤之一，特别是在东亚、东南亚国家，而每年约一半的新发和死亡病例是发生在中国[1]。随着现代医疗技术的进步，肝癌的诊疗手段已渐趋成熟，但是其术后5年的生存率仍只有15%～40%[2-3]，且每年的发病率与病死率基本持平。早期诊断并干预、术后再监测是提高肝癌患者预后的重要手段，但目前仍缺乏有效的诊疗、监测靶点[4]。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一群长度大于200 bp且不编码蛋白的RNA，以往认为其是RNA聚合酶II的转录副产物，不具备生物学功能[5]。但是近些年来研究表明，lncRNA广泛参与调控细胞功能，与人类疾病特别是肿瘤的发生发展密切相关[6-8]。而目前对lncRNA在肝癌发生发展中的作用仍知之甚少[9]。

本课题组从已完成的表达谱芯片（GSE 54238）中筛选lncRNA-AK125512，发现随着肝癌的发生发展进程“正常肝-慢性肝炎-肝硬化-肝癌”，其表达量发生明显变化，并且在肝癌、癌旁肝组织中亦明显差异表达，提示lncRNA-AK125512可能在肝癌的发生发展过程中发挥着重要作用。为此，我们采用实时荧光定量PCR法进一步验证其在肝癌、癌旁肝组织中的差异表达，并分析其与临床病理指标相关性以及与患者术后预后的关系，探讨其作为预测肝癌患者术后预后标记物的潜在价值，并为今后揭示肝癌发生发展机制研究和肝癌精准治疗提供可能靶点。

1 材料和方法

1.1组织样本

随机选取2010年3月至2012年3月在我院行根治性肝癌切除术并满足选取标准的HCC患者135例，选取标准为：（1）术前未接受其他抗癌治疗；（2）有完整的临床资料；（3）术后病理证实为原发性肝癌。术中另切取肝癌组织及相应癌旁肝组织（距离肿瘤边界＞2 cm，病理证实无肿瘤细胞）于-80 ℃冻存备用。所有患者均已签署相关知情同意书并获得医院伦理委员会批准。其详细临床病理指标见表1。

1.2随访

术后定期对患者预后进行随访，短期随访（1年内）主要以门诊复诊形式进行，远期随访（1年以上）主要以电话随访形式进行。术后前两年每3个月随访1次，两年后每6个月随访1次，随访截止日期为2015 年3月，中位随访时间为45.3（1～60）个月，无失访。随访内容包括：术后预后（进展、复发、死亡）、影像学变化、血AFP、肝功能等。

1.3主要试剂与仪器

RNA抽提试剂TRIzol（Takara，中国大连），RNA反转录试剂M-MLV Reverse Transcriptase Kit（Invitrogen公司），RNA荧光试剂SYBR® Premix Ex TaqTMII （Takara，中国大连）。NanoDrop2000超微量分光光度计（Thermo Scientific，USA），VeritiTM96孔热循环仪（Applied Biosystems，USA），StepOnePlusTM实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems，USA）。

1.4总RNA抽提及反转录

按说明书所述，使用Takara公司的Trizol抽提组织样本的总RNA并用NanoDrop2000超微量分光光度计测定其浓度、纯度。吸取1 μg的RNA，按照RNA反转录试剂M-MLV Reverse Transcriptase Kit说明书所述加入各试剂，使用VeritiTM96孔热循环仪进行反转录。反应参数：65 ℃ 5 min；37 ℃ 2 min；25 ℃10 min，37 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。

1.5实时荧光定量PCR检测lncRNA-AK125512的表达

根据GenBank中lncRNA-AK125512、β-Actin的碱基序列（序列号分别为AK125512.1、NM_001101.3），应用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物由上海杰李生物技术有限公司合成。lncRNA-AK125512的上游引物为：5′-TGACACCCACAACCTGA-3′，下游引物为：5′-TATACCCACTATGGAACCT-3′，产物片段大小为323 bp，退火温度为60 ℃。β-Actin的上游引物为：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′，下游引物为：5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′，产物片段大小为275 bp，退火温度为60 ℃。qRT-PCR的反应体系为20 μL，包括2×SYBR Green mix 10 μL，ddH2O 8 μL，20×相应引物1 μL，cDNA 1 μL。使用StepOnePlusTM实时荧光定量PCR系统进行实时荧光定量PCR，反应参数：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃20 s，共40个循环。结果用2-△△Ct法分析计算。

1.6统计学分析

实验结果应用SPSS 22.0软件进行统计分析。计数资料用x2检验，计量资料用Wilcoxon配对符号秩和检验，生存分析用Kaplan-Meier和Log-rank检验，多因素分析用Cox回归模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1lncRNA-AK125512在肝癌、癌旁肝组织差异表达

qRT-PCR结果经Wilcoxon配对符号秩和检验提示肝癌组织中lncRNA-AK125512较癌旁肝组织明显低表达（P＜0.0001），见图1。

图1　lncRNA-AK125512在肝癌组织、癌旁肝组织中的表达

2.2lncRNA-AK125512在肝癌中的表达与临床病理指标的相关性

以lncRNA-AK125512在135例肝癌组织中的相对表达量（2-△△Ct）的中位值为界，将lncRNA-AK125512的在肝癌组织中表达量分为低表达（n=67例）、高表达（n=68例）两组，并与临床病理指标构建四格表做x2分析。分析结果显示，肝癌组织中lncRNAAK125512的表达水平与肝癌分化分级（P=0.022）、肿瘤包膜完整与否（P=0.005）、血AFP（P=0.018）明显相关，与性别、年龄、有无肝硬化、巴塞罗那分期、肿瘤直径、有无子灶、有无微血管癌栓无关，见表1。

2.3lncRNA-AK125512在肝癌组织中的表达与肝癌患者术后无瘤生存期及总体生存期的关系

分别绘制lncRNA-AK125512低表达组和高表达组的Kaplan-Meier曲线并进行Log-rank检验，结果显示肝癌组织中lncRNA-AK125512低表达患者肝癌切除术后预后明显较差，表现为术后无瘤生存期（P= 0.0041）及总体生存期（P=0.0008）均显著缩短，见图2。

2.4单因素、多因素分析

将各临床病理指标分别做术后复发、生存的单因素分析，结果见表2。将单因素分析（表2）中有统计学意义的指标纳入进行多因素COX回归分析，结果见表3。结果表明，肝癌组织lncRNA-AK125512低表达、肿瘤直径＞5 cm、有子灶、无完整包膜是影响肝癌患者术后无瘤生存期的独立危险因素，肝癌组织lncRNA-AK125512低表达、肿瘤直径＞5 cm、有子灶、血AFP＞20 μg/L是影响肝癌患者术后总体生存期的独立危险因素。

表1　癌组织中lncRNA-AK125512的表达与临床病理指标的关系

3 讨论

lncRNA是近些年来的研究热点，研究表明其并非只是细胞内的“噪音分子”，相反，其广泛参与调控X染色体沉默、基因印记以及染色体修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等细胞重要生物学进程[6-7]，与多种疾病特别是肿瘤的发生发展、防治密切关联[8]。国内学者YANG等[10]率先应用高通量芯片技术检测了5对肝癌组织和癌旁肝组织的lncRNA表达谱，并筛选出在肝癌、癌旁肝组织中明显差异表达的lncRNAHEIH，发现其可作为肝癌患者术后预后的预测标记物，利用shRNA抑制肝癌细胞中的lncRNA-HEIH可以明显抑制肝癌细胞的生长周期，提示该lncRNA是肝癌治疗的可能靶点。但是，其较少的样本数量限制了对肝癌发生发展中相关lncRNA的全面分析、发现。所以，需要更大规模的数据、更为丰富的疾病谱用以系统地考察lncRNA在肝癌发生发展过程中的差异表达和潜在临床应用价值。

图2　肝癌组织中lncRNA-AK125512的高低表达与术后预后的关系

表2　肝癌患者术后预后的单因素分析

本课题组前期完成了表达谱芯片（NCBI GEO数据库编号GSE54238），包括10例正常肝脏组织、10例慢性肝炎组织、10例肝硬化组织、15例早期肝癌组织和14例伴随转移的晚期肝癌组织以及对应的癌旁肝组织。经过标准化数据处理后，我们发现肝癌、癌旁肝组织共发现有638条lncRNA明显差异表达（标准为差异倍数超过1.5倍，P＜0.05），这进一步表明了lncRNA广泛参与调控肝癌的发生发展。YUAN等[11]从其中筛选出lncRNA-DANCR，在两个队列中验证发现其可作为预测肝癌患者术后预后的标记物，lncRNADANCR可以增强肝癌细胞的干性特征从而促进肝癌的发生发展，干扰lncRNA-DANCR能有效阻断该效应，提示其可能是肝癌治疗的新靶点。

表3　肝癌患者术后预后的多因素分析

研究表明，人类基因组序列中4%～9%的序列产生的转录本是lncRNA，而相应的蛋白编码RNA比例只有1%[7]。显然，相较编码蛋白基因在肿瘤发生发展中作用的广泛性，我们对lncRNA在肿瘤发生发展、防治中的作用仍知之甚少，需要我们去进一步探究。基于此研究目的，本研究从已完成的GSE54238表达谱芯片中进一步筛选、发现lncRNA-AK125512随着肝癌的发生发展进程“正常肝-慢性肝炎-肝硬化-肝癌”，其表达量发生明显变化，肝癌、癌旁肝组织亦表达差异显著，提示我们该lncRNA可能是肝癌发生发展的重要调控因子，值得我们进一步研究。

本研究通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-AK12 5512在135对肝癌、癌旁肝组织中的表达量，结果表明其在肝癌组织中表达量明显低于癌旁肝组织，提示其可能具有抑制肝癌发生发展的作用，这在国内外尚属首次报道。进一步研究发现肝癌组织中lncRNAAK125512较低表达患者具有更差的肝癌分化分级、肿瘤包膜更不完整和更高的血AFP，提示我们其可能参与调控肝癌细胞分化，这为我们下一步揭示lncRNA-AK125512对肝癌细胞的具体调控功能及机制打下基础。分析预后发现肝癌组织中lncRNA-AK125512表达水平与肝癌患者术后预后明显相关，可用于预测肝癌患者术后预后，提示在临床工作中对肝癌组织中lncRNA-AK125512较低表达患者术后应进行更严密随访，监测复发，必要时予加强术后辅助治疗。

已有大量研究报道通过改变lncRNA表达能够抑制肿瘤细胞的恶性表型[10-11]，表明lncRNA可以作为肿瘤治疗的新靶点。而lncRNA-AK125512表达量的变化是否会对肝癌细胞恶性表型产生影响及具体的调控机制，目前尚无相关报道，这是我们下一步的研究重点，将进一步明确lncRNA-AK125512是否能够作为肝癌治疗的潜在靶点。研究表明lncRNA往往是通过调控其邻近mRNA而发挥生物学功能[12]，我们通过查阅UCSC基因组数据库发现lncRNA-AK125512位于人类1号染色体q41区段，与基因线粒体偕胺肟还原酶2 （MARC2）在相同位置，并与基因线粒体偕胺肟还原酶1（MARC1）毗邻。已报道MARC家族能消除细胞内的羟化物[13]，MARC2能够清除子宫颈癌细胞内羟胺基碱基类似物而抑制肿瘤细胞凋亡[14]。而lncRNA-AK125512是否通过调控MARC家族而影响肝癌发生发展需要进一步的实验证明。

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（本文编辑：张海燕，鲁翠涛）

·论著 临床研究·

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[通讯作者简介]周伟平，教授，主任医师，博士生导师，E-mail：ehphwp@126.com。

作者简介][第一蔡杰（1990-），男，福建莆田人，硕士；林孔英（1989-），男，福建平潭人，硕士，本文并列第一作者。

[基金项目]国家科技重大专项(2012ZX10002010）；国家自然科学基金项目（81372207）；上海市卫生和计划生育委员会科研课题（20154Y0083）。

[收稿日期]2015-09-09

[中图分类号]R735.7

[文献标识码]A

doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.02.002