痤疮颗粒微生物限度检查方法的建立

熊雯，程龙，郑萍



痤疮颗粒微生物限度检查方法的建立

熊雯，程龙，郑萍

[摘要]目的：建立痤疮颗粒的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010年版的规定，采用常规法进行微生物限度检查方法验证。结果：痤疮颗粒对细菌的抑制作用较小，常规法验证对五种试验菌的回收率均高于70％。结论：用该法进行微生物限度检查，可以客观地反映药物中微生物的污染状况，以达到检测目的。

[关键词]痤疮颗粒；微生物限度检查；方法验证

[作者单位]成都市食品药品检验研究院，四川成都610041

痤疮颗粒是以琵琶叶、桑白皮、生地、丹皮、赤芍等为主要成分的口服给药制剂。考虑到中药成分对细菌、霉菌和酵母菌可能存在一定的抑制作用[1～4]，常规检查方法不能真实地反映药品中微生物污染的情况，故应按照《中国药典》2010年版的要求[5]，对所采用的检查方法进行验证，以确认抑菌活性的消除和检查方法的有效性。

1　材料

1.1仪器

超净工作台（苏净集团安泰公司）SW-CJ-2FD；生物安全柜（苏净集团安泰公司）BHC-1000ⅡA/ B3；生化培养箱（上海一恒科技有限公司）LRH-250；隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）GHP-9270；微生物限度检验仪（杭州盈天科学仪器有限公司）YT-X300

1.2菌种

大肠埃希菌[CMCC(B) 44102]，金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]，枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501]，白色念珠菌[CMCC(F) 98001]，黑曲霉[CMCC(F) 98003]，铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104]，均为第4代，来源于中国药品生物制品检定所。

1.3培养基及试剂

营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，均由北京三药科技开发公司生产。

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，0.9％无菌氯化钠溶液，0.1％蛋白胨水溶液均由北京三药科技开发公司生产，聚山梨酯80由天津市美琳工贸有限公司生产。

1.4样品

痤疮颗粒（批号：131101；131201；140201）

2　方法与结果

2.1细菌数计数方法的验证

2.1.1常规法测定细菌数的方法验证

①菌液制备 取经35℃培养22 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 CFU．mL-1的菌悬液，做活菌计数备用；

②供试液制备 取本品10 g，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，45℃水浴，混匀得1:10供试液。

③回收率测定

供试品对照组 取1:10供试液1 mL，平行制备2个平板，测定供试品本底细菌数；

菌液组 分别取上述3种试验菌悬液1 mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，测定所加的试验菌数。

试验组 取1:10供试液1 mL和大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1 mL，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，35℃培养3天，计数；

④结果：三次独立的平行试验结果如下表所示

试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数×100％。

表1　常规法（1 mL/皿）验证细菌计数试验结果（CFU/皿）

表2　常规法（1 mL/皿）验证细菌计数试验结果（cfu/皿）

表3　常规法（1 mL/皿）验证细菌计数试验结果（cfu/皿）

综合表1、2、3可以看出，本品采用常规法（1 mL/皿）检查细菌数，在三次独立的平行试验中，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的人工染菌回收率均高于70％，因此，本品细菌计数可采用常规法（1 mL/皿）。

2.2霉菌和酵母菌数计数方法的验证

2.2.1常规法测定霉菌和酵母菌数的方法验证

①菌液制备 取经25℃培养24 h的白色念珠菌改良马丁培养基培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 CFU．mL-1的菌悬液，做活菌计数备用；

取经25℃培养7 d的黑曲霉菌改良马丁琼脂培养基斜面培养物，加5 mL含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液（用管口带有薄的纱布的无菌毛细吸管吸出胞子悬液）至无菌试管中，用含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 CFU．mL-1的孢子悬液，做活菌计数备用。

②供试液制备 取本品10 g，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，45℃水浴，混匀得1:10供试液。

③回收率测定

供试品对照组 取1:10供试液1 mL，平行制备2个平板，测定供试品本底霉菌和酵母菌数。

菌液组 分别取上述2种试验菌悬液1 mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，测定所加的试验菌数。

试验组 取1:10供试液1 mL和白色念珠菌、黑曲霉菌悬液1ml倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，25℃培养5天，计数。

结果 试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数×100％。

表4　常规法验证霉菌和酵母菌计数试验结果（cfu/皿）

从表4可以看出，本品采用常规法检查霉菌和酵母菌数，在三次独立的平行试验中，供试品对白色念珠菌和黑曲霉的人工染菌回收率均高于70％，因此，本品霉菌和酵母菌计数可采用常规法（1 mL/皿）。

2.3控制菌检查方法的验证

2.3.1大肠埃希菌检查方法的验证

①供试液制备 取本品10 g，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，45℃水浴，混匀得1:10供试液。

②菌液制备 取经35℃培养22 h的大肠埃希菌的营养肉汤培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 CFU．mL-1的菌悬液，做活菌计数备用；③常规法检查大肠埃希菌

试验组 取1:10供试液10 mL及制备好的大肠埃希菌悬液1 mL加入到100 mL的胆盐乳糖培养基中，35℃培养22 h。吸取0.2 mL培养物接种至5 mL MUG培养基中，35℃培养，于5 h、24 h在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，观察颜色变化。

阳性对照组 取制备好的大肠埃希菌菌悬液1 mL加入到100 mL的胆盐乳糖培养基中培养，其他操作同试验组。

供试品对照组 取1:10供试液10 mL加入到100 mL胆盐乳糖培养基中，其他操作同试验组。

阴性对照组 取10 mL pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液加入到100 mL胆盐乳糖培养基中，其他操作同试验组。

2.3.2结果

表5　大肠埃希菌检查方法（胆盐乳糖培养基：100 mL）验证结果

由表5可知，阴性对照组和供试品对照组中，紫外灯下观察和靛基质反应均呈阴性，而试验组加入大肠埃希菌培养后，366 nm紫外下呈现荧光，且加入靛基质后，液面呈玫瑰红色，都和阳性对照组一样。因此，本品大肠埃希菌可采用常规法（胆盐乳糖培养机100 mL）进行检查。

3　讨论

本品可采用常规法进行细菌计数、霉菌和酵母菌计数以及控制菌的检查。根据验证结果将微生物限度检查方法记录如下：取本品10 g，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，45℃水浴，摇匀得1:10供试液。细菌计数、霉菌和酵母菌计数以及控制菌均采用常规法进行检查，所建立方法可有效地控制痤疮颗粒的微生物限度。

[参考文献]

[1]陈佳佳,廖森泰,孙远明,等.中草药抑菌活性成分研究进展[J].中药材,2011,34(8):1313.

[2]杨淑文.32种中草药抑菌活性的比较研究[J].安徽农业科学,2011,39(3):1361.

[3]苏德模,马绪荣.药品微生物学检验技术[M].北京:华龄出版社: 221．

[4]潘雯,关倩明,林玲.7种具有抑菌成分中成药的微生物限度检查方法验证[J].广东药学院学报, 2012, 28(6):623.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典[s].北京:中国医药科技出版社,2010:附录 ⅪJ108.

（责任编辑：陈思敏）

Validation of microbial limit test method of Cuochuang Keli

XIONG Wen, CHENG Long, ZHEN Pin
(ChengDu Institutes for Food and Drug Control, Chengdu, 610041, China )

[Abstract]Objective: To establish a method for the microbial limit test of Cuochuang Keli.Method: According to the Chinese Pharmacopoeia 2010 edition, the routine method was performed for microbial limit test validation of Cuochuang Kei.Result: Cuochuang Keli hardly had the antimicrobial activity.The routine method was feasible for microbial limit test.Conclusion: This method applied for microbial limit test can objectively reflect the status of microbial contamination in drugs so as to meet the destination of examination.

[Key words]Cuochuang Keli; microbial limit test; validation

[收稿日期]2015-03-17

[通讯作者]郑萍(1969-), 女, 主任药师, 主要从事药品质量控制研究 Email: zhengping028@foxmail.com

[作者简介]熊雯(1978-)，女，硕士研究生，副主任药师，主要从事药品质量控制研究Tel:028-85362197 Email:xiongwen613@163.com

[中图分类号]R 283.3

[文献标识码]A

[文章编号]1674-926X(2016)01-012-03