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自组装法制备丝心蛋白微球

2016-04-22肖新才邓萌萌熊小翠张瑞连

关键词:微球

肖新才, 邓萌萌, 肖 咪,熊小翠,张瑞连

(中南民族大学 药学院,武汉430074)



自组装法制备丝心蛋白微球

肖新才, 邓萌萌, 肖咪,熊小翠,张瑞连

(中南民族大学 药学院,武汉430074)

摘要采用自组装法以脱胶天然蚕丝为原料,制备了丝心蛋白微球.对影响微球的成球效果的因素如搅拌速度、乙醇(EtOH)用量、丝心蛋白(SF)浓度和冷冻温度进行了初步探索.结果表明:当V(EtOH) /V(SF)=1︰20,w(SF)=7.0%时,以n=100 r/min的速度进行搅拌,再放入-20℃环境下冷冻24 h最后室温融化,可获得较理想的丝心蛋白微球.

关键词自组装;丝心蛋白;微球

Preparation of Fibroin Microspheres by Self-assembly Method

XiaoXincai,DengMengmeng,XiaoMi,XiongXiaocui,ZhangRuilian

(College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074,China)

AbstractFibroin microspheres of degummed natural silk were successfully prepared by self-assembly method. The effect of stirring speed, amount of ethanol, concentration of fibroin and freezing temperature on the forming of the microcapsules were investigated. The results indicated that well shaped fibroin microspheres could be prepared with a stirring speed of 100 r/min, aV(EtOH)︰V(SF) ratio of 1︰20,w(SF) = 7.0%, followed by freezing at -20℃ for 24 h, and finally melting at room temperature.

Keywordsself-assembly; fibroin; microspheres

丝心蛋白是以脱胶蚕丝为原料制成的纤维蛋白质,由1条H链和1条L链通过 S-S 键结合而成,主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成[1].近年随着生物技术的迅速发展和广泛应用,国内外对丝心蛋白的研究利用越来越重视,为丝心蛋白及其水解产物在医药卫生、生物技术、化妆品、食品等领域中的应用展示了广阔的前景.丝心蛋白在药物缓释,特别是价格昂贵、性质敏感的蛋白质、多肽以及基因药物缓释方面的应用正成为一个新的研究热点[2,4],其作为烧伤创面覆盖膜、抗凝血材料、骨修复支架等材料,具有无毒无刺激、稳定较好性等特点,为药物提供了有利的载体条件[5,6].从生物相容性、药物相容性和可控释性来看, 丝心蛋白均有望成为新一代的蛋白质和基因药物的控释载体[7,8].

纳米和微米级的微球因具有比表面积大、低密度、高稳定性等特性而作为一种新的功能性材料,在药物控释领域具有广泛应用[9,10].随着研究的不断深入,国内外对丝心蛋白微球的制备技术不断发展,如乳化法、喷雾干燥法、相分离法、层流射流技术等[11,12],但由于丝心蛋白属于蛋白质类,其性质的不稳定性导致其微球的制备效果不理想.

自组装法[13]是如今制备丝心蛋白微球较有效且具有发展前景的方法,其中蛋白质或多肽分子自组装主要依靠氢键、静电相互作用和疏水相互作用等次级键的作用[14],以保证蛋白质能够在制备过程中有效避免使用乳化法、喷雾干燥法、相分离法、层流射流技术等方法中存在的高速搅拌、有毒有机溶剂等其他制备方式对蛋白质活性的损害问题,保持了丝心蛋白良好的生物活性.本文用自组装法初步探索了丝心蛋白微球的制备,研究了搅拌速度、乙醇(EtOH)用量、丝心蛋白(SF)浓度和冷冻温度对影响微球的成球效果的影响,以期采用较简捷的设备和常用药品来制备圆球状、粒径约200 nm的丝心蛋白微球.

1实验部分

1.1试剂和仪器

氢氧化钠(NaOH, 国药集团化学试剂有限公司),溴化锂(LiBr, 阿拉丁试剂公司), 无水乙醇(C2H5OH, 国药集团化学试剂有限公司),天然蚕丝.

聚热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S型, 巩义市予华仪器有限责任公司),透射电子显微镜(TecnaiG2 20S-TWIN, FEI公司),电子天平(AR2140型, 上海奥豪斯仪器有限公司),数显电动搅拌器(DW-3型,巩义市予华仪器有限责任公司),动静态激光散射仪(BI-200SM/BI-200SM, 美国布鲁克海文).

1.2方法和原理

1.2.1制备原理

蚕丝是由丝心蛋白(SF)和丝胶两部分组成,丝胶包裹在丝心蛋白的外部,丝心蛋白是蚕丝的主要组成部分,约占重量的70%. 丝心蛋白以反平行折叠链构象为基础,形成直径约10 nm的微纤维,无数微纤维密切结合成直径约为1 μm的细纤维,约100根细纤维沿长轴排列构成直径约10 ~18 μm的单纤维,即蚕丝蛋白纤维.丝心蛋白纤维分子在乙醇作用下,使丝心蛋白由无规则卷曲,转换成β-折叠结构形成微晶,随后在冷冻过程中,提供的剪切力诱导丝心蛋白构象发生改变,形成一种微型球体.

1.2.2蚕丝的脱胶处理

称取一定量的蚕丝,置于1.0 mol/L NaOH调节至pH 10.5的蒸馏水中,浴比(质量比)1︰100,温度100℃,在电热恒温槽中脱胶30 min.换液保持同样条件重复煮沸4次,煮后用约40℃的去离子水反复洗涤后于烘箱(50℃)中烘干备用.

1.2.3丝心蛋白的预处理

将脱胶后的蚕丝用9.5 mol/L的LiBr溶液在60℃下溶解,将少许不溶物过滤除去,剩余溶液放入透析袋中用去离子水透析4 d以除去其中的LiBr,将透析好的丝心蛋白溶液放入4000 r/min的离心机中离心10 min,取上清液放入4℃冰箱备用.

1.2.4丝心蛋白微球的制备

取一定体积的上述丝心蛋白溶液并稀释到100 mL,取40 mL该溶液于100 mL的三颈烧瓶中,通过滴液漏斗向丝心蛋白溶液中缓慢滴加乙醇溶液,低速搅拌30 min,随后再将溶液放入低温下冷冻24 h,拿出后常温下融化,制得丝心蛋白微球.表1归纳了制备丝心蛋白微球的各种条件参数.

表1 制备丝心蛋白微球的实验参数

1.2.5微球形貌和粒径的分析表征

微球的形貌和粒径是其两个重要的参数,实验中采用透射电子显微镜(TEM)观察微球的结构和粒径.

2结果与讨论

2.1冷冻温度对丝心蛋白成球的影响

a) t=-10℃; b) t=-15℃; c) t=-20℃图1 不同的冷冻温度下的微球的TEM图Fig.1 TEM images of the microspheres under different freezing temperatures

冷冻温度对丝心蛋白的成球效果有影响,丝心蛋白首先在乙醇的作用下,构象由无规则卷曲转换成β-折叠结构,在这个过程中丝心蛋白分子链彼此缠绕,形成一个物理交联的凝胶,低温冷冻能导致丝心蛋白分子链的运动受限,在有限的空间内凝胶粒子被挤压成微型球状体,当冷冻温度较低时,其成球效果较好.如图1所示,当冷冻温度在-20℃时更利于成球,故后续的冷冻条件均设置为-20℃. 2.2不同丝心蛋白溶液浓度对丝心蛋白微球成球的影响在制备的过程中丝心蛋白可以在乙醇的作用下形成一种微晶结构,随着丝心蛋白浓度的增加形成的微晶和游离状态的丝心蛋白纤维的作用大大增加,微晶与自由丝素分子反应机会以及微球间的反应都增加,在有限的空间中,丝心蛋白的浓度较大时其成球的效果较好.图2 是不同的丝心蛋白浓度下形成的微球的TEM图片,从图可见,得到的结果与分析相符.

2.3搅拌速度对丝心蛋白微球成球的影响

a) w(SF)=1.0%; b) w(SF)=3.0%; c) w(SF)=5.0%; d) w(SF)=7.0%图2 不同的丝心蛋白浓度下形成的微球的TEM图Fig.2 TEM images of the microspheres with different concentration of fibroin

a) n=100 r/min; b) n=200 r/min;c) n=300 r/min图3 不同搅拌速度时微球的TEM图Fig.3 TEM images of the microspheres with different stirring speed

图3 为不同搅拌速度时微球的TEM图片.当搅拌速度增加时,制备出的微球效果较差.随着搅拌速度的增大,剪切力增大,而在巨大的剪切力长时间作用下微球的粒径减小,但微球表面容易破裂,导致成球效果差,同时丝心蛋白是蛋白质类,在高速搅拌的过程中会形成大量泡沫并不易散去,使一些颗粒吸附在泡沫中,影响成球性.为了获得更均一、成球性较好的微球,在整个过程中均以n=100 r/min的速度进行搅拌.

2.4不同乙醇和SF的体积比对丝心蛋白微球成球的影响

a) V(EtOH)/V(SF) = 1∶20; b) V(EtOH)/V(SF) = 3∶20; c) V(EtOH)/V(SF) = 4∶20图4 不同乙醇的加入量下形成微球的TEM图Fig.4 TEM images of the microspheres with different amount of ethanol

虽然丝心蛋白从无规卷曲结构到在乙醇作用下变成β-片微晶是一个自发过程,但这个过程的转变率依赖于加入乙醇的体积,同时大剂量的乙醇能迅速导致蛋白质变性,经实验发现乙醇与SF溶液的体积比会影响丝心蛋白微球成球的效果.不同体积比的成球效果见图4,由图4可见随着乙醇量的增加其成球效果变差,当V(EtOH) /V(SF) = 1︰20时较容易成球.

2.5影响丝心蛋白微球成球的因素

综上影响因素,当V(EtOH) /V(SF) = 1∶20,CSF=7.0%(w/w),搅拌的速度为n=100 r/min,并t=-20℃的冷冻温度冷冻的条件下能制备出形态和大小较理想的微球.由图5a可见,合成出来的纳米粒为均匀的圆球形,由图5b可见,用动静态散射激光仪进行粒径大小的表征,粒径为198 nm的纳米粒所占比例最大,达到了本实验所预期的采用较简捷的设备和常用药品来制备圆球状、粒径约200 nm的丝心蛋白微球的效果.

V(EtOH)/V(SF) = 1∶20;w(SF)=7.0%; n=100 r/min;t =-20℃图5 丝心蛋白微球的TME图及其粒径分布Fig.5 TEM image(a) and particle size distribution(b) of SF microspheres

3结语

本文采用自组装法以脱胶蚕丝作为原料制备了丝心蛋白微球,对影响丝心蛋白微球的成球效果的条件如乙醇用量、丝心蛋白浓度、冷冻温度和搅拌速度进行了初步探索.结果表明:当V(EtOH)/V(SF) = 1∶20,w(SF)=7.0%,搅拌速度为n=100 r/min,并以t=-20℃的冷冻温度冷冻24 h,最后在室温融化的条件下,能较成功地制备出丝心蛋白微球,其中采用了常见的试剂乙醇和最简易的装置,简便安全地制备出了丝心蛋白微球.

参考文献

[1]王宏昕, 李敏. 丝素蛋白作为组织工程生物材料的研究进展[J]. 中国修复重建外科杂志, 2008, 22(2):192-195.

[2] Numata K, Kaplan D L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2010, 62(15): 1497-1508.

[3] Mandal B B, Mann J K, Kundu S C. Silk fibroin/gelatin multilayered films as a model system for controlled drug release[J]. J Pharm Sci, 2009, 37(2): 160-171.

[4] Lammel S A, Hu X, Kaplan D L, et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery[J]. Biomaterials, 2010, 31(16): 4583-4591.

[5] 马芳, 邹凤竹. 丝素蛋白在生物材料领域的应用研究概况[J]. 山东农业大学学报, 2005, 36(4): 632-636.

[6] 李苹, 刘利萍, 吴泽志, 等. 丝素在生物医学领域中的应用[J]. 重庆大学学报, 2002, 25(7): 75-78.

[7] Hofmann S, Foo C T, Rossetti F, et al. Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery[J]. J Control Release, 2006, 111(1/2): 219-227.

[8] Hardy J G, Scheibel T R. Composite materials based on silk proteins[J]. Prog Polym Sci, 2010, 35(9): 1093-1115.

[9] 邓字巍, 陈敏, 周树学, 等. 一种制备单分散二氧化硅空心微球的新方法[J]. 高等学校化学学报, 2006, 27(10):1795-1798.

[10] 黄永利, 吕强, 李明忠, 等. 电场调控载药丝素蛋白微球的制备[J].科学通报, 2011, 56(13):1013-1018.

[11] Wenk E, Wandrey A J, Merkle H P, et al. Silk fibroin spheres as a platform for controlled drug delivery[J]. J Control Release, 2008, 132(1): 26-34.

[12] Wang X Q, Yucel T, Lu Q, et al. Silk nanospheres and microspheres from silk/pva blend films for drug delivery[J]. Biomaterials, 2010, 31(6):1025-1035.

[13] Cao Z B, Chen X, Yan J R, et al .The preparation of regenerated silk fibroin microspheres [J]. Soft Matter, 2007, 3(7):910-915.

[14] 潘岳林, 杨明英, 张海萍, 等. 丝素微球的制备方法研究进展[J]. 氨基酸和生物资源, 2014, 36(4):8-11.

中图分类号TQ028.8; R944.5

文献标识码A

文章编号1672-4321(2016)01-0050-05

基金项目国家自然科学基金资助项目(21276287,20976202);中央高校基金科研业务费专项资金资助项目(CZW15017);中南民族大学学术团队资助项目(XTZ15013)

作者简介肖新才(1971-),男,教授,博士,研究方向:生物医用材料,E-mail:xcxiao71@yahoo.com.cn

收稿日期2015-09-14

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