眼针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑皮层组织TLR4、MyD88表达的影响

赵丹玉　苗兰英　曹　阳　王德山

(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁　沈阳　110847)



眼针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑皮层组织TLR4、MyD88表达的影响

赵丹玉苗兰英曹阳王德山

(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁沈阳110847)

〔摘要〕目的探讨眼针治疗脑缺血再灌注损伤(CIRI)模型大鼠脑皮层组织中Toll样受体4(TLR4)及髓样分化因子88(MyD88)的作用机制。方法健康雄性SPF级Wistar雄性大鼠60只，随机分为正常组、假手术组、CIRI模型组和眼针组。CIRI模型组和眼针组采用改良的线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MACO)动物模型。酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠血清白细胞介素(IL)-1β水平，Western 印迹检测大鼠缺血侧脑皮层TLR4、MyD88蛋白表达的变化。结果与正常组及假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β水平明显升高(P<0.01)，缺血侧脑皮层组织TLR4、MyD88蛋白水平均显示高表达(P<0.01)；眼针组同模型组相比，血清IL-1β水平显著下降(P<0.01)，缺血侧脑皮层组织TLR4、MyD88蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论眼针抑制脑皮层组织中TLR4、MyD88的表达，降低炎症反应，可能是眼针治疗CIRI的主要作用机制之一。

〔关键词〕眼针；脑缺血再灌注；TLR4；MyD88

眼针疗法是在眼眶周围进行针刺防治疾病的一种微针疗法，其理论基础是眼通过经络系统与脏腑密切相连。临床上根据不同脏腑、器官的病变和病位选取相应的穴位进行针刺，从而达到治疗全身不同部位疾病的目的。多年的临床实践证明，本疗法对于急性脑缺血性疾病具有很好的疗效，然而眼针治疗脑缺血性疾病的作用机制尚亟待研究阐明。本课题建立大鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)模型，观察眼针对大鼠血清白细胞介素(IL)-1β水平及损伤侧脑皮质Toll样受体4(TLR4)和髓样分化因子88(MyD88)蛋白表达的影响，研究眼针对CIRI的作用机制,为“眼络于脑”的中医理论假说提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料健康雄性SPF级Wistar雄性大鼠60只，体重280~320 g。购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2008-0016。IL-1β ELISA试剂盒、一抗GAPDH、TLR4及MyD88多克隆抗体、羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2动物分组与模型复制60只大鼠以随机数字法分为正常组、假手术组、模型组和眼针组，剔除造模不成功以及死亡鼠，最终每组均为12只。

正常组：常规喂养无任何施加因素。模型复制与成模标准：采用改良的线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MACO)动物模型(右侧栓塞)〔1〕。造模后参照Longa 5分制评分标准进行神经功能缺损评分〔2〕。神经功能缺损评分≥1分视为造模成功。将造模成功的大鼠再随机分为模型组和眼针组。假手术组：术式与操作基本过程同模型组和眼针组，只是不进行大脑中动脉栓塞。模型组常规喂养，不给予任何刺激。眼针组在缺血再灌注即刻、造模术后12、24 h(即处死前)各进行眼针1次。

1.3眼针取穴与刺法参照人体取穴定位法分别取上焦区、下焦区、肝区、肾区；刺法：用35×25 mm毫针在相应眼穴区距眶内缘2 mm处，平刺，由该区始点向该区终点方向，刺入0.3 cm，行捻转手法，留针30 min，15 min行针1次，时间1 min。

1.4血清IL-1β含量的测定各组大鼠CIRI术后24 h麻醉后腹主动脉取血，分离血清后按照武汉博士德生物工程公司IL-1β的ELISA试剂盒说明进行操作。

1.5Western 印迹检测TLR4及MyD88蛋白表达于造模术后24 h每组各取6只鼠，麻醉后,迅速断头取脑，于无菌条件下冰上分离右侧皮层组织，加入相应体积的裂解液后匀浆， 12 000 r/min离心30 min，收集上清，检测各样本蛋白浓度。将样品和蛋白分子量标准分别加入胶孔内开始电泳。电泳完毕，半干式转印槽印迹约1.5 h，封闭，37℃，2 h，加入适当稀释的一抗(TLR4、MyD88、GAPDH均以1∶100用封闭液稀释)，4℃过夜。TBST冲洗后加入1∶2 000稀释的酶标二抗，37℃，45 min。DAB显色。扫描硝酸纤维素膜上的条带，凝胶扫描系统进行吸光度积分分析(IOD)，以GAPDH作为内参，各组TLR4、MyD88的蛋白表达强度IOD和内参GAPDH的蛋白表达强度IOD比值显示各组TLR4、MyD88的蛋白表达。

2结果

2.1眼针对CIRI 模型大鼠一般状态影响正常组及假手术组大鼠无神经功能缺损体征出现，根据神经功能缺损评分标准评分均为0分。模型组及眼针组大鼠术中死亡7只，另外有5只大鼠神经功能缺损不明显，即将造模成功的大鼠随机分为模型组和眼针组各12只。造模成功的大鼠苏醒后出现明显的不能完全伸展对侧前爪、向对侧转圈及向对侧倾倒等神经功能缺损症状。术后24 h,模型组动物神经功能缺损症状随时间延长逐渐加重，神经功能缺损评分具有明显的上升趋势；眼针组神经功能缺损症状加重不明显，显示出眼针治疗的脑保护作用。

2.2眼针对CIRI模型大鼠血清IL-1β含量的影响假手术组〔(44.04±4.47)μg/mg〕同正常组〔(45.30±4.10)μg/mg〕比较，血清中IL-1β含量没有明显差异(P>0.05)。模型组血清中IL-1β含量〔(83.94±5.15)μg/mg〕显著升高(P<0.01)；眼针组血清中IL-1β含量〔(61.13±3.43)μg/mg〕明显下降(P<0.01)。

2.3眼针对CIRI模型大鼠大脑皮层组织TLR4、MyD88蛋白表达影响如图1、表1所示，正常组及假手术组大鼠右侧大脑皮层组织TLR4、MyD88蛋白均表达较少，二者之间没有显著差异(P>0.05)；与正常组与假手术组相比较，CIRI模型组TLR4、MyD88均呈现明显高表达(P<0.01)；而眼针组表达较模型组明显下降(P<0.05)。

图1　TLR4、MyD88蛋白印迹

表1　各组TLR4、MyD88蛋白表达水平比较

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

3讨论

TLR4是Toll样受体(TLR)家族的成员之一，属于I型跨膜受体蛋白。其胞外区负责识别病原菌或内源性配体；胞内区具有TIR结构域，主要作用是介导细胞应答的信号启动，参与炎症反应或炎症病理反应。MyD88属于TLR家族和死亡结构域家族成员，其羧基端具有TIR结构域，可以同TLR4的TIR结构域结合；氨基端具有死亡结构域(DD)，可以募集细胞内的IL-1受体相关激酶(IRAK)并使其磷酸化。TLR4作为膜结合蛋白，当与配体结合后，其胞内的TIR结构域连接胞内衔接蛋白MyD88，进而启动下游IRAK磷酸化，继而激活肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAF)〔3~6〕，激活核因子(NF)-κB，促进多种细胞因子及炎症因子的表达，启动炎症反应〔7，8〕。此为MyD88依赖的TLR4信号转导通路。

CIRI的病理生理是一个多环节、多因素、多途径损伤的级联反应过程〔9〕，其发病机制目前也没有完全研究清楚，但是已证实，脑缺血再灌注时的炎症反应促进了继发性脑损害,是CIRI的主要原因之一〔10〕。已有大量的研究表明，TLR4与CIRI密切相关〔11，12〕。本课题的前期研究以及对于血清IL-1水平的检测均证明了CIRI时炎症反应明显加强。模型组大鼠缺血侧大脑皮层组织TLR4蛋白表达明显增高〔13〕，同以往的研究结果一致。结合本实验对于模型组大鼠缺血侧大脑皮层组织MyD88蛋白表达的检测结果，CIRI时有可能由于某些内源性炎症介质的释放促进了TLR4的表达，极有可能激活了TLR4介导的MyD88依赖的信号转导通路，从而使NF-κB活化，启动TNF-α、IL-1β等炎症因子的转录，加重了CIRI时炎症反应。而眼针组大鼠缺血侧大脑皮层组织TLR4及MyD88的蛋白表达均显著降低。说明眼针刺激能够抑制TLR4及MyD88的表达，进而抑制其下游蛋白的活化，抑制NF-κB与炎症因子的结构基因上游的调控序列结合，抑制炎症因子的表达而减轻其炎症反应，从而达到对脑皮层组织的保护目的，这可能是眼针对于CIRI有显著疗效的机制之一。至于MyD88表达的下调是TLR4表达下调后的结果还是眼针刺激的调节靶点，还有待于今后作进一步的研究。

4参考文献

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4Janssens S,Beyaert R.A universal role for MyD88 in TLR/IL-1R-mediated signaling〔J〕.Trends Biochem Sci,2002;27(12):474-83.

5McGettrick AF,O'Neill LA.The expanding family of MyD88-like adaptors in Toll-like receptor signal transduction〔J〕.Mol Immunol,2004;41(6-7):577-82.

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7Velayudham A,Hritz I,Dolganiuc A,etal.Critical role of Toll-like receptors and the common TLR adaptor,MyD88,in induction of granulomas and liver injury〔J〕.J Hepatol,2006;45(6):813-24.

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10孔立红，刘胜洪，毛娟娟，等.电针对脑缺血大鼠 NF-κB 及 TNF-α表达的影响〔J〕.中国康复医学杂志，2009；24(8):711-4.

11高音，王玉，张翠香，等.TLR4与TNF-α在脑缺血再灌注小鼠海马CA1区神经元中的表达〔J〕.神经解剖学杂志，2010；26(2):175-80.

12Caso JR,Pradillo JM,Hurtado O,etal.l Toll-like receptor4 is involved in brain damage and inflammation after experimental stroke〔J〕.Circulation,2007;115(12):1599-608.

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〔2013-07-30修回〕

(编辑曲莉)

Influences of eye acupuncture on the expression of IKKβ/NF-κB in rat's brain after acute cerebral ischemia/reperfusion

ZHAO Dan-Yu,MIAO Lan-Ying,CAO Yang,etal.

College of Basic Medical,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the expressions of TLR4 and MyD88 in cerebral ischemia-reperfusion injury(CIRI) in rat brain cortex and the effect of eye acupuncture.MethodsAdult male SPF Wistar male rats were randomly divided into normal,sham operation,CIRI model and eye acupuncture groups.The model of middle cerebral artery occlusion(MACO) was established by the improved suture method.ELISA method was performed to determine the IL-1β level,Western blot was performed to examine the protein expressions of TLR4 and MyD88 in the ischemic brain cortex.ResultsThe IL-1β level and protein expressions of TLR4 and MyD88 in CIRI model group were increased significantly ( P< 0.01) compared with those in normal and sham operation groups,and which were decreased significantly (P<0.01) in eye acupuncture group.ConclusionsEye acupuncture therapy could reduce the IL-1β level and expressions of TLR4 and MyD88 in CIRI ,which might be the treatment mechanism of eye acupuncture therapy on CIRI rat .

【Key words】Eye acupuncture; Cerebral ischemia and reperfusion;TLR4;MyD88

〔中图分类号〕R28516

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)07-1547-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.005

通讯作者：王德山(1951-)，男，教授，博士生导师，主要从事中医药对消化道神经内分泌影响机制的研究。

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2007CB512700)；辽宁省教育厅课题(No.L2010349)

第一作者：赵丹玉(1978-)，女，博士，副教授，主要从事中医药对受体及受体后信号转导途径影响机制的研究。