真人养脏汤对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜sIgA、γδT细胞和超微结构的影响

王　慧　许惠玉　官　杰　吴艳敏　谭佳音

(齐齐哈尔医学院免疫教研室,黑龙江　齐齐哈尔　161006)



真人养脏汤对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜sIgA、γδT细胞和超微结构的影响

王慧许惠玉官杰吴艳敏谭佳音

(齐齐哈尔医学院免疫教研室,黑龙江齐齐哈尔161006)

〔摘要〕目的通过观察真人养脏汤(ZRYZ)对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠肠黏膜分泌性免疫球蛋白(sIg)A、γδT细胞百分率和电镜超微结构的影响，探讨其对UC模型大鼠肠黏膜的修复作用。方法采用TNBS/乙醇灌肠法复制UC模型大鼠，肉眼观察评价结肠组织形态；ELISA法检测结肠黏膜sIgA水平变化；流式细胞术测γδT细胞百分率；透射电镜观察结肠黏膜超微结构改变。结果肉眼可见模型组大鼠结肠组织黏膜层出现炎症及溃疡；电镜下见结肠黏膜上皮细胞微绒毛消失，内质网扩张，线粒体明显肿胀；结肠组织sIgA含量、γδT细胞百分率均显著降低，与空白组比较有显著差异(P<0.05或 P<0.01)；各治疗组大鼠结肠黏膜损伤情况均有改善，电镜下见结肠黏膜上皮细胞有较多粗短微绒毛，未见内质网扩张及线粒体肿胀；sIgA含量、γδT细胞百分率均较模型组显著升高(P<0.01)。结论真人养脏汤通过影响肠黏膜sIgA合成、γδT细胞表达，减轻UC模型大鼠结肠黏膜上皮细胞病变，对UC模型大鼠肠黏膜免疫屏障具有一定的修复作用。

〔关键词〕溃疡性结肠炎；分泌性免疫球蛋白A；γδT细胞；超微结构；真人养脏汤

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性结肠疾病，是现代医学的难治病之一，近年在我国发病率呈明显上升,其病因复杂，涉及免疫、遗传、环境、感染等因素，该病临床上表现为腹泻,黏液，脓血便,腹痛及里急后重,其病理特点为结肠黏膜的慢性炎症和溃疡形成。因此改善结肠黏膜炎症，促进黏膜修复是治疗的关键〔1〕。真人养脏汤(ZRYZ)出自宋代《太平惠民和剂局方》,能够温补脾肾、涩肠固脱。本实验通过观察ZRYZ对UC模型大鼠肠黏膜分泌性免疫球蛋白(sIg)A含量、γδT细胞百分率和电镜超微结构改变，探讨其对UC模型大鼠肠黏膜免疫屏障的修复作用。

1材料与方法

1.1动物清洁级雄性SD大鼠90只，体质量(220±20)g，购于哈尔滨医科大学实验动物学中心，动物合格证号：SCXK(黑)2013-001。

1.2实验药物与试剂ZRYZ：组方在古文献记载基础上略改动药物组成：人参、当归、炒白术、肉豆蔻、肉桂、炙干草、白芍、木香、诃子。药材由齐齐哈尔市中医医院中药房提供，水煎浓缩至生药量2 g/ml，高压灭菌后冰箱保存备用；柳氮磺吡啶肠溶片(SASP)上海信谊天平药业有限公司，国药准字：H31020557，使用前用蒸馏水配制成0.05 g/ml；5%2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma公司，货号：P2297；sIgA试剂盒(CUSABIO公司，批号：CSB-E08412r)；γδT-PE抗体(美国eBioscience公司)。

1.3仪器电热恒温水浴箱(中国上海医疗器械五厂)；Safire2型多功能全波长酶标仪(瑞士Tecan)；石蜡包埋机(中国湖北欧美莱医疗科技有限责任公司)；手动旋转式石蜡切片机(德国Slfe)；流式细胞仪(美国BECTON DICKINSON)；高速低温冷冻离心机(德国 Eppendorf)；透射式电子显微镜(日本日立HITACHI)；超薄切片机(瑞典 LKB)。

1.4方法

1.4.1造模方法随机抽取15只大鼠，设为空白组，其余大鼠进行造模。采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型：将大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.25 ml/100 g)后，一次性将TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用改良的大鼠灌胃针轻缓注入大鼠距肛门约7～8 cm深的肠腔内，注射完毕用手捏住肛门停留数分钟，防止溶液外漏，让动物保持下腹部上倾状态，注意保暖，自然清醒。空白组15只大鼠也采用同样方法用等量的0.9%生理盐水溶液灌肠。

1.4.2分组与给药12 h后观察造模动物，约85%大鼠出现稀便和血便。3 d后，随机处死5只动物，取距肛门约7～8 cm处结肠，肉眼可见溃疡面，表明造模成功。造模动物随机分成模型组、SASP、ZRYZ低、中、高剂量组共5组，每组均14只大鼠。ZRYZ低、中、高剂量组分别按生药7.6、15.2及30.4 g/kg剂量灌胃(按照临床成人用量的5、10及20倍折算)，SASP组按0.5 g/kg剂量灌胃(按照临床成人用量的10倍折算)，空白组、模型组灌服等体积0.9%生理盐水溶液。各组于造模后第3天开始灌胃，1次/d，连续21 d。

1.4.3标本采集及指标检测

1.4.3.1肠组织病理学观察末次给药后禁食不禁水24 h，处死大鼠，取距肛门大约8 cm结肠，沿纵轴剪开，用冰生理盐水清洗干净，肉眼观察结肠大体形态、结肠黏膜损伤情况，大体形态损伤评分参照Luketal标准进行：0分：无损伤；1分：充血但没有溃疡；2分：充血而且肠壁变厚但没有溃疡；3分：有一处小溃疡，直径约0~1 cm；4分：溃疡较大，直径约1~2 cm，但肠管与外周脏器无粘连；5分：溃疡直径1~2 cm，肠管增厚，与周围脏器粘连严重〔2〕。

1.4.3.2结肠组织黏膜中sIgA含量取病变结肠下段，大约距肛门4 cm，用PBS洗去血污，在4℃生理盐水中将肠组织翻转，洗净，刮取肠内膜组织。称取100 mg所取组织，剪成小块加入1 ml PBS 进行组织匀浆，然后置于-20℃过夜后，ELISA法测定组织中sIgA含量。

1.4.3.3结肠组织中γδT细胞检测载玻片刮取病变肠内组织，300目铜网过滤，制成肠组织细胞悬液，离心，取1×106细胞。FACS420流式细胞仪上进行检测。

1.4.3.4结肠上皮细胞超微结构观察取2～3块大小为1 mm×1 mm×1 mm组织固定后，超薄切片进行透射电镜观察结肠上皮细胞超微结构。电镜样品的制作和观察由齐齐哈尔医学院超微病理实验中心完成。

1.5统计学方法采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1一般状态模型组及各治疗组大鼠均出现稀便，肛周污浊，体毛晦暗无光泽，饮食饮水量均减少，喜欢聚群。部分大鼠有肉眼可见脓血便，体质量下降明显。给药10 d后各治疗组状体均有改善，其中ZRYZ中、低剂量组、SASP组明显好转，大部分大鼠稀便和脓血便症状消失，粪便呈颗粒状，毛色润泽光亮，食量和饮水量正常，不再聚群，活跃度高，体质量增长明显。

2.2结肠上皮细胞超微结构观察空白组大鼠结肠黏膜上皮表面的微绒毛结构完整,上皮细胞连接紧密，细胞间隙无明显异常改变。模型组大鼠结肠黏膜上皮细胞微绒毛脱落，细胞间隙增宽，内质网扩张，线粒体肿胀，部分细胞质溶解，并可见凋亡现象。ZRYZ高剂量组细胞微绒毛排列欠整齐，细胞间隙增宽程度有所减轻，腺上皮细胞间连接较紧密。ZRYZ中剂量组和低剂量组大鼠结肠黏膜上皮细胞有较多的粗短微绒毛，排列整齐，大小一致，细胞排列整齐，细胞间隙增宽程度明显减轻，腺上皮间相互连接紧密，未见扩张的内质网及肿胀的线粒体。SASP组大鼠结肠黏膜上皮表面的微绒毛排列整齐，稀疏，但无脱落，内质网及线粒体未见明显病理形态学改变，见图1。

图1　各组大鼠结肠上皮细胞超微结构观察(×13 000)

2.3结肠黏膜损伤情况模型组大鼠结肠黏膜可见明显充血、水肿、溃疡、肠道缩短，部分还出现坏死及粘连，与空白组比较具有显著性差异(P<0.05)。ZRZY中剂量组、低剂量组、SASP组及ZRZY高剂量组大鼠结肠黏膜仅有少量的充血水肿，与模型组比较有显著差异(P<0.01或P<0.05)。见表1。

2.4结肠组织黏膜中sIgA含量变化模型组大鼠结肠组织黏膜中sIgA含量显著下降，与空白组比较具有显著差异(P<0.01)；ZRZY各组和SASP组大鼠结肠组织黏膜中sIgA含量显著下降，与空白组比较具有显著差异(P<0.01或P<0.05)。见表1。

2.5结肠组织中γδT细胞水平变化模型组大鼠结肠组织中γδT细胞百分率显著下降，与空白组比较，具有显著差异(P<0.01)；ZRZY各组和SASP组大鼠结肠组织中γδT细胞百分率显著下降，与空白组比较，具有显著差异(P<0.01)。 见表1。

表1　ZRYZ对UC模型大鼠结肠黏膜损伤评分及

与空白组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与SASP组比较：5)P<0.05，6)P<0.01

3讨论

肠道免疫屏障由肠上皮细胞、肠上皮内淋巴细胞、固有层淋巴细胞、派伊氏结和肠系膜淋巴结等肠道组织及肠道浆细胞sIgA构成〔3〕。生理情况下，机体可通过肠黏膜屏障来有效地阻止致病微生物和毒素的侵入，以保证机体处于健康状态〔4〕。当肠黏膜屏障损伤时，肠道中的微生物和毒素便可突破肠黏膜屏障，进入门静脉和淋巴系统引起细菌移位，发展为UC。原发性和继发性结肠损害，都会损伤黏膜及其功能。

sIgA是免疫球蛋白(Ig)A单体通过J链连结而成的二聚体，主要由肠黏膜固有层浆细胞产生。sIgA主要在黏膜局部免疫当中发挥重要作用，进入肠道能选择性地包被革兰阴性菌，形成抗原抗体复合物，阻碍细菌与上皮细胞受体相结合，刺激肠道黏液分泌并加速黏液层的流动，有效地阻止细菌对肠黏膜的黏附，并且其在穿胞过程中对于已潜入细胞内的病毒同样具有中和作用〔5〕。创伤后，肠道产生sIgA的功能明显受到抑制，主要表现为sIgA含量减少，合成sIgA的浆细胞数量减少及被sIgA包被的革兰阴性菌数量减少，肠道抗定植力下降，促进肠内细菌移位〔6〕。

γδT细胞在正常人外周血所占比例甚少，但在表皮及肠黏膜上皮组织中大量存在〔7〕。研究表明〔8，9〕，γδT细胞能够通过调节免疫应答，在机体抗感染、抗肿瘤、自身免疫性疾病中发挥重要作用。它主要分布于皮肤、黏膜上皮等部位，当有病原微生物入侵时迅速活化和增殖，因此常作为机体抵抗外界病原菌的第一道防线。在黏膜免疫应答中，γδT细胞通过分泌IL-2和IL-6等细胞因子促进黏膜局部淋巴组织中的B细胞活化、增殖，分泌大量抗原特异的sIgA，增强黏膜免疫，阻止病原菌的进一步入侵。UC中结肠黏膜受损，导致γδT细胞缺失，肠道内环境破坏。

本实验结果说明ZRYZ可能通过升高结肠黏膜sIgA含量和增加结肠组织γδT百分率，从而提升黏膜局部免疫功能，恢复结肠黏膜的免疫屏障功能，达到治疗目的。

4参考文献

1 Taba Taba Vakili S,Taher M,Ebrahimi Daryani N.Update on the management of ulcerative colitis〔J〕.Acta Med Iran,2012;50(6):363-72.

2Luke HH,Ko JKS,Fung HS,etal.Delineation of the protective action of zinc sulfate on ulcerative colitis〔J〕.Eur J Pharmacol,2002;443:197-204.

3徐凯进,李兰娟.肠道正常菌群与肠道免疫〔J〕.国外医学·流行病学传染病学分册,2005;32(3):181-3.

4高金生,杨书良.肠黏膜屏障损伤的原因与机制研究进展〔J〕.世界华人消化杂志,2009;17(15):1540-4.

5彭乃宝.维护肠道屏障功能的重要性及措施〔J〕.齐齐哈尔医学院学报，2005;26(10):1182-4.

6李恒鑫.胃肠道黏膜免疫与动物营养调控〔J〕.饲料工业,2005;26(21):51-3.

7吕冠华,王长洪,杨杰,等.大承气汤对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜分泌性IgA及CD3、γδT细胞的影响〔J〕.中国中西医结合消化杂志,2010;18(5):282-7.

8Raspollini MR，Castiglione F,Rossi-Deglinnocenti D,etal.Tumour-infiltrating gamma/delta T-lymphocytes are correlated with a brief disease-free interval in advanced ovarian serous carcinoma〔J〕.Ann Oncol,2005;16:590-6.

9Bank I，Duvdevani M,Livneh A.Expansion of gammadelta T-cells in Behcet’s disease:role of disease activity and microbial flora in oral ulcers〔J〕.J Lab Clin Med,2003;141:33-10.

〔2015-10-11修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

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〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)07-1565-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.013

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目(No.12531798)

第一作者：王慧(1978-)，女，硕士，讲师，主要从事中医药治疗炎症性疾病的机制研究。