成年大鼠心室肌细胞的急性分离方法

施光正　马丽娟　赵海军

(浙江医学高等专科学校，浙江　杭州　310053)



成年大鼠心室肌细胞的急性分离方法

施光正马丽娟赵海军1

(浙江医学高等专科学校，浙江杭州310053)

〔摘要〕目的介绍一种新型的成年大鼠心肌细胞的急性分离方法。方法麻醉大鼠后快速取心脏，为心脏先循环灌流无钙台氏液，后循环灌流酶液，酶解完成后取左心室，迅速置于含0.5 mg/ml BSA的KB液(恒温37℃)中拉碎，吹打数次后离心，去上清，温育在含0.5 mg/ml BSA的KB溶液中35 min，梯度复钙。结果首次分离细胞存活率在80%~90%，复钙完成仍有40%~50%的细胞维持杆状，横纹清晰且90%以上细胞处于静止状态。结论通过该方法可获得稳定、高比例的存活心肌细胞，能够为成年大鼠心肌细胞原代培养及电生理学研究提供高品质细胞。

〔关键词〕心肌细胞； 急性分离； Langendorff灌流

能够得到高活性的心肌细胞是心肌细胞培养和电生理研究的基础，随着酶解法的不断完善与创新，酶解法成为获取成年大鼠心肌细胞的主要方式，但迄今为止尚未有完全统一的分离方法，本文主要阐述笔者的实验方法。

1材料及方法

1.1材料Wistar雄性大鼠20只，220~250 g，由上海斯特莱动物责任有限公司提供(动物许可证号SCXK〔沪〕2012-0002)。

1.2主要试剂Ⅱ型胶原酶(C6885)、XⅣ型蛋白酶(P5147)、BSA(A1933)、Taurine(T0625-100G)、G-Lutamic acid(G8415)NaH2PO4、KOH Sigma公司NaCl、KCl、Glucose、KH2PO4、MgCl2国产分析纯HEPES、EGTA BIOSHARP。

1.3主要实验仪器恒温水浴槽：JKI-MP-501A；超纯水：MILLI-Q；倒置镜：LeicaDMI3000B；Langendorff：自制灌流装置。

1.4溶液配方无钙台式液:HEPES 15 mmol/L、MgCl21 mmol/L、NaCl 135 mmol/L、KCl 4 mmol/L、NaH2PO41 mmol/L、Glucose 10 mmol/L(NaOH调整溶液pH值为7.4)，KB液： L-Glutamic acid 50.3 mmol/L、KCl 39.97 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、Taurine 19.98 mmol/L、MgCl23 mmol/L、KOH 80 mmol/L、EGTA 0.53 mmol/L、HEPES 10.7 mmol/L、Glucose 10.09 mmol/L(KOH调整溶液pH值为7.4)，酶液:0.16%蛋白酶、0.1%胶原酶、0.5 mg/ml胎牛血清(BSA，溶于无钙台氏液)

1.5实验步骤

1.5.1实验准备利用恒温水浴槽、蛇形玻璃罐、60 ml注射器、普通输液管道及调控开关搭建Langendorff灌流装置，如图1。75%乙醇溶液灌洗装置3~5次，再使用去离子水灌洗3~5次。所有灌流液氧饱和15 min。

图1　灌流装置示意图

1.5.2细胞分离断头处死大鼠，剪刀沿胸骨左右两侧剪开，用止血钳夹住剑突，胸廓前翻，充分暴露胸腔，剪断上下腔静脉，自主动脉根部5 mm处剪断主动脉。迅速将心脏置入4℃无钙台氏液中，修剪心脏，适当除去周围组织，清洗血液，迅速将心脏悬挂至Langendorff灌流装置上，3号丝线结扎固定，进行主动脉逆灌流，修建剩余的心脏周围组织。先灌流无钙台式液3~5 min冲洗心脏剩余血液，无钙台式液剩余5 ml时加入5 ml酶液预灌流，待灌流液剩余5 ml继续加入酶液，舍弃前10 ml的酶液，剩余酶液循环灌流12~15 min，酶解完成时心脏外观主体呈现黄色和淡红色，略微显白，膨大30%~50%。取下心脏，在恒温37℃含0.5 mg/ml BSA的KB液中剪取左心室，使用两个镊子拉碎心脏组织，吹打数次后300 r/min离心3 min，静止3~5 min，去上清液，加入含0.5 mg/ml BSA的KB溶液里温育30~40 min。等待复钙。

1.5.3梯度复钙分0.25、 0.5和1.0 mmol/L 3个梯度复钙。去上清液，加入无钙台氏液溶液和50 μl 0.1 mol/L CaCl2溶液，细胞悬液总体积在20 ml，静置10 min。重去上清液10 ml，加入10 ml 无钙台式液和75 μl 0.1 mol/L CaCl2溶液，静置10 min。重去上清液10 ml，加入10 ml无钙台式液和150 μl CaCl2溶液。最终溶液中钙离子浓度为1.0 mmol/L，将细胞悬液保存在4℃冰箱中或将细胞保存在4℃KB液中待用。

2结果

首次分离下的细胞在镜下观察，80%~85%的细胞呈长杆状，细胞膜完整，横纹清晰，透光度高，部分细胞核可见，与周围边界清晰且90%以上处于静止状态，少部分处于收缩状或已收缩成团状(图2)。复钙后，40%~50%的细胞维持杆状，90%以上的杆状细胞处于静止状态，胞膜完整边缘清楚，表面光滑，立体感强，横纹清晰，透光度好(图3)。

图2　首次分离心肌细胞(×100)

图3　梯度复钙后的心肌细胞(×100)

3讨论

Langendorff装置分离心肌细胞的方法技术已经很成熟，采用酶解法获取成年大鼠的心肌细胞分离已长达40多年的时间，但迄今为止，尚未建立统一的方法，这是因为成年大鼠心肌细胞的急性分离方法受到了诸多因素的影响，如悬挂心脏速度、酶的选择、酶浓度和酶解时间、复钙浓度与方法、水pH、灌流液pH、环境温度、灌流液温度和大鼠状态等〔1〕。

笔者认为其难点之一在于对心脏酶解完成时间的判断，消化时间过长，酶会破坏细胞的细胞膜，造成不可逆的损伤；消化未完全，细胞产量将会降低，且靠强烈的吹打分离细胞对细胞膜也有一定的破坏性。有文章通过恒流灌流心脏来观察灌流压变化的方法来确定心脏的消化终点〔2〕,但不同的酶与大鼠之间的个体差异会使得心脏的消化终止压不能完全统一，且操作较为复杂。钙反常现象是此实验的另一大难点，高比例的存活心肌细胞在无钙的环境下被分离出来，但是细胞再次进入生理浓度的钙溶液时，会诱发内质网释放大量的Ca2+，使胞质内钙离子浓度迅速升高，抑制了心肌细胞舒张过程中必需的钙离子和肌钙蛋白的解离，细胞表现为不停地收缩，逐渐变圆，失去原有结构，最终呈团状〔3，4〕。虽然在经过复钙后心肌细胞存活比例会减小部分，但最终得到的心肌细胞的质量会显著提高。

针对以上的问题，本实验从以下几个方面展开讨论：①熟练性：从大鼠开胸到将心脏悬挂上Langendorff装置的整个过程需要操作者有较高的熟练性，整个过程最好在2 min内完成。②灌流装置的搭建：本文搭建的灌流装置主要依靠重力势差作为灌流动力，制作较为简便且经济，通过控制普通输液器的开关或保持灌流管内液面的高度，可以控制灌流液的流速。整个装置的高度在80~100 cm，可以放置在超净台中完成，使分离下的细胞处于无菌环境，因此分离的心肌细胞适用于原代培养。③灌流液的选择：选用无钙台氏液灌流时，保证了细胞的无钙环境，同时对桥粒和闰盘的分离也起一定的作用〔5〕。本实验选用Sigma公司的Ⅱ型胶原酶，浓度为0.1%，联合使用Sigma公司0.16%的蛋白酶和0.5 mg/ml的BSA配置成酶液30 ml循环灌流，酶液中的BSA具有细胞保护修复作用〔4〕，适宜的BSA在增加心肌细胞对酶耐受性的同时也能保护蛋白水解酶对胶原酶的水解，因此在酶液中加入BSA可以保护心肌细胞，也能够保障酶的活性。④消化终点的判断：本实验通过观察心脏颜色与心脏大小来判断心脏消化终点，根据实验中的观察，灌流酶液前心脏呈红色，质地较软。灌流酶液后心脏开始膨胀，质地变硬，红色逐渐退去，黄色渐渐明显，在消化终点时心脏膨大30%~50%，心脏主体呈现黄色和淡红色，略微显白，此时应立即终止酶的消化。⑤复钙：据报道心肌细胞的活性状态是直接导致“钙反常”的根本原因，而实验的每一步都可能影响到心肌细胞的状态。⑥消化组织在KB液中完全拉碎后，应使用光滑圆头的滴管小心吹打，注意不可混入空气产生泡沫，且吹打次数不可过多，6~8次即可。另外，KB液温度保持37℃，且加入0.5 mg/ml BSA可以提升细胞的钙耐受性。试验中发现，在消化组织吹打离心后，将分离细胞温育在含0.5 mg/ml BSA的KB液中30~40 min有利于修复细胞膜，保持细胞膜的完整，但不可时间过长，使得BSA粘覆在细胞膜表面，影响其后的电生理学实验〔6〕。未复钙细胞在用于电生理研究时细胞直接接触含钙电极外液，复钙过程太快导致大部分的细胞死亡，而四步法复钙时间较长〔7〕。本实验发现通过三步法“0.25、 0.5 、1.0 mmol/L 3个梯度复钙”后细胞状态较好，能够减轻“钙反常”，提高存活细胞比例。

4参考文献

1廖华，糜涛，涂志业，等.成年大鼠心肌细胞分离方法的改良〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2009;13(33):6536-9.

2王云英,张然,余志斌.低压恒流灌流分离成年大鼠心肌细胞〔J〕.中国应用生理学杂志,2005;21(4):475-8.

3熊寿贵,余更生.成年大鼠心肌细胞的急性分离方法探讨〔J〕.重庆医科大学学报,2008;33(7):864-7.

4Farmer BB,Mancina M,Williams ES,etal.Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts:review of the literature and description of a method〔J〕.Life Sci,1983;33(1):1-18.

5姚泰,吴博威.生理学〔M〕.第 6 版.北京:人民卫生出版社,2005:34-9.

6李慈珍,刘远谋,王红卫,等.耐钙心肌细胞的分离和电生理特性观察〔J〕.中国应用生理学杂,1994;10(4):359-62.

7赵临,汪玲芳,尹永强,等.适合膜片钳实验的心肌细胞分离方法研究〔J〕.天津医科大学学报,2010;16(1)：12-4.

〔2015-09-26修回〕

(编辑袁左鸣)

〔中图分类号〕R332

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)07-1578-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.018

通讯作者：赵海军(1977-)，男，副教授，主要从事毒理学研究。

基金项目：浙江省教育厅项目(Y201226128，201330225，JA15815)

1厦门医学高等专科学校

第一作者：施光正(1996-)，男，在读本科生，主要从事心肌细胞电生理学研究。