叶酸挽救乙醇致斑马鱼胚胎心脏和流出道发育异常

孙淑娜　姚泽忠　蒋　璆　桂永浩

(1复旦大学附属儿科医院心内科　上海　201102; 2上海市闵行区中心医院儿科　上海　201199;

3上海市心血管病研究所　上海　200032)



叶酸挽救乙醇致斑马鱼胚胎心脏和流出道发育异常

孙淑娜1,2姚泽忠2蒋璆3桂永浩1△

(1复旦大学附属儿科医院心内科上海201102;2上海市闵行区中心医院儿科上海201199;

3上海市心血管病研究所上海200032)

【摘要】目的观察乙醇对斑马鱼胚胎心脏和流出道发育的干扰作用,并初步探讨叶酸挽救乙醇所致心脏和流出道发育异常的最佳时段和可能机制。方法在斑马鱼胚胎发育不同时段予以乙醇处理,观察胚胎的发育异常情况。将受精后7～12 h被予以乙醇组定义为乙醇处理组。在乙醇处理组胚胎的发育不同时段给予外源性叶酸进行叶酸挽救实验,观察各叶酸干预组胚胎的发育状况,探寻叶酸挽救的最佳时段。将受精后7～12 h给予叶酸组定义为叶酸挽救组。观察并统计乙醇处理组以及叶酸挽救组的胚胎发育异常百分比、存活百分比、心脏和流出道形态及其异常百分比、心率、心室收缩指数等指标来评估胚胎的发育状况。利用荧光显微造影的方法探查心脏流出道形态,采用胚胎整体原位杂交和Real-time PCR 方法检测胚胎bmp2b、tbx1的表达情况。结果乙醇可干扰胚胎发育,乙醇处理组胚胎存在明显心脏和流出道形态异常以及心功能损害,在胚胎发育早期乙醇的干扰作用最明显。给予外源性叶酸能挽救乙醇导致的胚胎发育异常,在胚胎受精后7～12 h叶酸挽救作用最显著。乙醇处理组胚胎心脏和流出道的bmp2b、tbx1表达下降;予以叶酸干预后,乙醇处理组胚胎bmp2b和tbx1表达水平上调。结论叶酸能有效挽救乙醇导致的心脏和流出道发育异常,其机制可能是上调乙醇处理组胚胎bmp2b、tbx1的表达水平。

【关键词】叶酸;乙醇;心脏;流出道;斑马鱼;bmp2b;tbx1

*This work was supported by Youth Research Fund of Shanghai Municipal Health Bureau (20124y086) and Opening Project of Key Laboratory of Birth Defects Prevention in Shanghai.

先天性心脏病是胚胎时期心血管系统发育异常所导致的先天性疾病,严重危害儿童生命和健康,其发病率在活产婴儿中约为6‰～8‰。先天性心脏病环境致病因素中的乙醇摄入不容忽视。妇女妊娠期间摄入乙醇过量对胚胎发育有严重影响,可导致胎儿酒精综合征,表现为心血管系统发育障碍、胚胎头面部畸形和神经系统损伤。心血管系统发育异常在胎儿酒精综合征患儿中发生率较高[1]。目前乙醇导致胚胎发育异常的确切机制尚未完全阐明,探寻有效的方法挽救妊娠期孕母乙醇摄入所致胚胎发育异常逐渐成为研究热点。

叶酸在生物生长和发育过程中扮演重要的角色,它参与生物体内许多重要反应和重要物质的合成。有研究表明,通过抑制二氢叶酸还原酶功能而使叶酸生物学活性受抑后可导致心脏发育障碍,且心脏发育关键转录因子bmp2b以及tbx1的表达水平下调[2-3]。人群中母亲怀孕期间予以补充适量的叶酸可降低子代发生先天性心脏病的风险[4]。在小鼠中叶酸可降低胚胎酒精综合征的发生[5],在斑马鱼中叶酸可挽救乙醇导致的视网膜等发育异常[6]。但目前围绕叶酸挽救乙醇所致胚胎心血管系统发育异常的最佳时段及其相关机制研究较少。本研究旨在观察乙醇对胚胎发育的干扰作用,并探寻叶酸挽救乙醇所致胚胎心血管系统发育异常的最佳时期,并通过检测心血管发育密切转录因子bmp2b以及tbx1的表达水平进行初步机制探讨,为临床合理预防乙醇所致先天性心脏病提供理论与实验依据。

材 料 和 方 法

实验动物斑马鱼受精卵按照Kimmel等[7]描述对发育阶段分期,受精卵置于孵化液(60μg/mL海盐)28 ℃孵化,出绒毛膜后在胚胎培养液内养育,每天更换胚胎培养液。用于原位杂交的胚胎在24 hpf(hours post fertilization,受精后小时数)开始用0.003%苯硫脲处理以防止黑色素的形成。

乙醇处理将乙醇溶解于胚胎培养液内,根据预实验结果,选用250 mmol/L的乙醇进行实验。在胚胎如下不同发育阶段予以乙醇：0～6 hpf、7～12 hpf、13～18 hpf、19～24 hpf、25～30 hpf、31～36 hpf、37～42 hpf、43～48 hpf。每组100枚胚胎,实验重复3次,设正常对照组胚胎100枚。

给予外源性叶酸将叶酸(购自Sigma公司,美国)溶解于胚胎培养液内配成5 mmol/L叶酸溶液。将7～12 hpf乙醇处理组胚胎分别在如下发育的不同阶段给予外源性叶酸： 0～6 hpf、7～12 hpf、13～18 hpf、19～24 hpf、25～30 hpf、31～36 hpf、37～42 hpf、43～48 hpf。每组100枚胚胎,实验重复3次,设正常对照组胚胎100枚。

胚胎整体发育情况的观察在显微镜下观察各组胚胎整体发育情况,记录各组胚胎存活个体百分比以及发育异常百分比。死亡个体也列入发育异常个体计数中。

心脏及流出道发育情况的观察在胚胎发育至48 hpf时,在显微镜下观察对照组、乙醇处理组、叶酸挽救组胚胎的心脏发育形态,并记录各组心脏发育异常个体百分比,每组20枚胚胎,实验重复3次。在48 hpf和60 hpf时统计各组胚胎的心率以及心室收缩指数(VSF),每组20枚胚胎。

另在上述各组胚胎发育至60 hpf时向胚胎心脏内注射3 nL荧光素,在荧光显微镜下观察胚胎心脏流出道的发育情况并记录各组心脏流出道发育异常个体百分比。每组20枚胚胎,实验重复3次。

基因探针制备及胚胎整体原位杂交抽提各组斑马鱼胚胎总mRNA后,经RT-PCR逆转录获得cDNA。采用Primer3软件设计引物,以逆转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增特异性基因序列作为原位杂交的探针片段。将PCR产物切胶回收,克隆入PGEM-T载体中,经测序验证后,获得含有目的基因cDNA片段的质粒,利用内切酶将其线性化后,体外转录反义RNA探针(地高辛标记)。进行原位杂交实验时每组各20枚胚胎,每组重复3次实验。构建基因探针及原位杂交所用试剂主要购自Promega 公司、美国罗氏公司、Takara公司。

Real-time PCR抽提斑马鱼48 hpf的总mRNA,经RT-PCR逆转录获得cDNA。采用Primer3软件设计引物,由Sangon生物公司合成。bmp2b引物：F:5′-CTTCCTCCTCCGAGGCTT-3′,R:5′-ACTGGCATCTCCGAGAACTT-3′。tbx1引物：F:5′-GAGACTGTGATCCCGAGGAC-3′,R:5′-TCATGATTTGTAGCGAGCCT-3′。以逆转录的cDNA为模板进行扩增,以β-actin 作为内参对照,每个样品重复3个孔。实验结果采用ABI7000荧光定量PCR仪提供的分析软件进行分析。Real-time PCR 所用SYBR Green荧光染料购自美国罗氏公司。

结果

乙醇导致斑马鱼胚胎发育异常对各不同时段乙醇处理组的胚胎整体发育情况进行观察和统计的结果显示,乙醇可导致胚胎发育异常,随着处理时段的向后推移,胚胎发育异常百分比逐渐降低(图1),存活百分比逐渐升高(图2)。在18hpf之前予以乙醇处理的胚胎发育异常比例大于50%,其中0～6hpf处理组和7～12hpf处理组发育异常百分比(死亡个体也计入发育异常)分别达92.67%±3.06%和85.33%±3.06%。但0～6hpf处理组的存活百分比(43.33%±3.11%)较7～12hpf处理组(80.67%±0.89%)降低。故在后续实验中,我们将7～12hpf作为斑马鱼胚胎的乙醇处理时间窗,定义为乙醇处理组。乙醇处理组胚胎存在躯干长度缩短、头部偏小、尾部弯曲、心脏畸形等发育异常(图3)。

A:Control group；B:Ethanol group,C:Ethanol+ folic acid group.Left lateral views,heads toward left.Bar:200μm.

图3胚胎整体发育情况的观察(48 hpf)

Fig 3The phenotypical overview of zebrafish

embryos at 48 hpf

乙醇处理组胚胎心脏和心脏流出道发育异常乙醇处理组胚胎与正常发育的对照组胚胎相比,在48 hpf时心脏发育异常百分比达81.67%±7.64%,表现为心前区水肿,心房和心室的位置形态异常,心房和心室不同程度扩张(图4),心脏跳动减慢且收缩无力。对心率和VSF的统计结果显示,与正常对照组相比,乙醇处理组胚胎在48 hpf和60 hpf心率和VSF皆下降(图5)。60 hpf荧光显微造影结果显示正常对照组的心脏流出道已发育完善,显影清晰;乙醇处理组胚胎(76.67%±7.64%)存在明显心脏流出道发育不全(图6)。

A and a:Control group;B and b:Ethanol group；C and c:Ethanol +folic acid group.a,b and c are conceptual diagrams of hearts.Arrow V:Ventricle;Arrow A:Atrium.Left lateral views,heads toward left.Bar:100μm.

图4心脏的形态观察(48 hpf)

Fig 4The phenotypical analysis of zebrafish heart at 48 hpf

乙醇处理组胚胎bmp2b、tbx1表达减弱Real-time PCR 结果显示,与正常对照组相比,乙醇处理组中bmp2b和tbx1的整体表达水平明显下降(图7)。

图5各组胚胎心率(A)和心室收缩指数(B)的比较

Fig5Thefunctionalanalysisofzebrafishheartby

heartrate(A)andVSF(B)

A:Control group;B:Ethanol group;C:Ethanol+folic acid group.Arrows indicate OFTs.Left lateral views,heads toward left.Bar:100μm.

图6心脏流出道的形态观察(60 hpf)

Fig 6The phenotypical analysis of zebrafish outflow

tract (OFT) at 60 hpf

原位杂交实验结果显示,与正常对照组相比,乙醇处理组胚胎bmp2b在心脏中的表达明显减弱,tbx1在心脏流出道中的表达强度降低(图8)。

图7Real-timePCR检测bmp2b和tbx1在胚胎的整体表达情况

Fig7bmp2bandtbx1expressionsanalysis

byreal-timePCR

A,B and C:The expression ofbmp2bat 48 hpf,arrows indicated the expression ofbmp2bin hearts.D,E and F:The expression oftbx1 at 60 hpf,arrows indicated the expression oftbx1 in OFTs.Compared with control group,expressions ofbmp2bandtbx1 decreased in ethanol group.Compared with ethanol group,expressions ofbmp2bandtbx1 increased in ethanol +folic acid group.A and D:control group,B and E:ethanol group,C and F:ethanol +folic acid group.A,B and C:Dorsal views,heads to the top.D,E and F:Left-lateral views,heads to the left.Bar:200μm.

图8胚胎整体原位杂交法检测bmp2b和tbx1在心脏及流出道的表达情况

Fig 8bmp2bandtbx1 expressions analysis byinsituhybridization in heart and OFT

叶酸可挽救乙醇处理组胚胎发育异常将乙醇处理组胚胎在不同发育时段给予外源性叶酸后,发现18 hpf之前给予叶酸,可显著提高乙醇处理组胚胎的存活百分比(图9),12 hpf前给予叶酸,可显著降低乙醇处理组胚胎的发育异常百分比(图10)。其中在7～12 hpf给予外源性叶酸后,乙醇处理组的发育异常百分比降低最显著,存活百分比升高最明显,因此将在7～12 hpf给予乙醇处理组外源性叶酸定义为乙醇+叶酸处理组,即叶酸挽救组进行后续实验。

图9乙醇处理组和各乙醇+叶酸处理组的存活百分比比较

Fig9Comparationofsurvivalpercentagesinethanol

groupandethanol+folicacidgroups

图10乙醇处理组和各乙醇+叶酸处理组的发育异常

百分比比较

Fig10Comparationofabnormalpercentagesinethanol

groupandethanol+folicacidgroups

与乙醇处理组相比,叶酸挽救组胚胎心脏发育异常个体百分比降低(41.67%±2.89%);心脏形态发育状况明显改善,表现为胚胎心房和心室的形态及位置趋于正常(图4),而且心率和VSF在各时间点明显增加(图5)。荧光显微造影结果显示叶酸挽救组与乙醇组相比,心脏流出道发育异常个体百分比明显下降(31.67%±5.77%),且心脏流出道发育情况明显改善(图6)。

叶酸挽救组胚胎bmp2b及tbx1表达增强Real-time PCR 结果显示,与乙醇处理组相比,叶酸挽救组的bmp2b及tbx1整体表达水平明显下降(图7)。原位杂交结果显示与乙醇处理组相比,bmp2b及tbx1在叶酸挽救组心脏以及流出道中的表达明显增加(图8)。

讨论

先天性心脏病的致病因素错综复杂,包括环境因素以及遗传因素。孕母乙醇摄入是先天性心脏病较为常见的环境致病因素,利用模式生物对其发病机制进行研究并探寻有效的防治方法有十分重要的现实意义。

本研究利用模式生物斑马鱼开展。斑马鱼与人类基因同源性较高;且其繁殖量大、发育周期短,适用于本实验中的大规模表型筛选和观察;另外斑马鱼在受精后72 hpf内(即从受精卵发育至幼鱼)不需要给予饲料喂养,其胚胎生长的主要营养物质(包括叶酸等)来自于受精卵内的卵黄,各受精卵的叶酸供给是均等的,提高了本研究中叶酸挽救实验的准确性。

目前国内外一些学者利用模式生物斑马鱼,围绕乙醇导致胚胎发育异常的机制进行研究。发现乙醇可影响底索分泌Rada和Ang-1等血管形成因子,干扰斑马鱼背主动脉的形成[8],提示乙醇可干扰斑马鱼胚胎血管发育。但在整个胚胎心脏发育时期中,乙醇导致心脏发育异常的最敏感时段有待于探讨,乙醇导致心血管系统发育异常的机制亦尚未明确。斑马鱼胚胎心脏在48 hpf即已发育完善,本研究首先通过预实验用不同浓度的乙醇处理斑马鱼胚胎,经过反复实验观察,发现250 mmol/L乙醇可导致胚胎发生明显发育异常,且存活率相对较高;因此选择250 mmol/L乙醇进行后续实验。我们将0 hpf到48 hpf划分为不同时段进行乙醇处理,发现乙醇在胚胎发育早期12 hpf之前对胚胎发育的干扰作用最显著,其中7～12 hpf处理组胚胎的发育异常百分比和存活百分比皆较高,因此将7～12 hpf处理组定义为乙醇处理组。后续实验发现,乙醇处理组胚胎存在明显心脏和流出道形态学发育异常。且通过对心率、心室收缩指数进行心功能评估，结果发现乙醇处理组胚胎存在心率下降、心室收缩功能受损。我们推测乙醇有可能通过影响心脏发育密切相关因子的表达而导致胚胎心脏和流出道发育异常。

在心脏发育密切相关转录因子中,bmp2b在调控心脏收缩功能方面有重要作用[9],tbx1对于心脏流出道发育十分关键[10-11]。且我们前期研究发现,叶酸生物学活性降低可导致bmp2b和tbx1的表达水平降低[2-3]。因此我们检测了bmp2b以及tbx1的表达情况。首先利用Real-time PCR检测bmp2b以及tbx1在胚胎内的整体表达水平,结果发现bmp2b以及tbx1的表达水平降低。我们进而通过胚胎整体原位杂交的方法检测此两个基因在心脏和流出道特定部位的表达情况,发现bmp2b以及tbx1在乙醇处理组胚胎心脏和流出道的表达水平也降低,提示乙醇可能通过下调bmp2b以及tbx1的表达而导致胚胎心脏发育异常。

在先天性心脏病的防治策略中,对一些导致先心病发生的环境高危因素进行控制并采取改善措施至关重要。发现孕母摄入乙醇后,及时有效地采取措施防止乙醇影响胎儿的心血管系统发育有十分重要的意义。叶酸是一种十分重要的维生素,我们前期研究发现叶酸生物学活性降低可导致斑马鱼胚胎发生明显心脏和流出道异常,且心脏发育关键转录因子的表达水平降低[2-3,12-13]。在人群中进行的流行病学调查结果也显示人群中叶酸缺乏可导致先天性心脏病的发生率明显上升[14],而母亲孕期适当补充叶酸可以有效预防先心病的发生[4,15]。国内外学者研究发现,叶酸可以有效防治乙醇摄入导致的胚胎视网膜病变[6],但叶酸挽救乙醇导致胚胎心血管发育异常的最佳干预时段有待于探讨,其挽救的机制尚未明确。本研究结果发现,在乙醇处理组胚胎发育早期7～12 hpf及时予以叶酸干预,可以有效地改善胚胎心脏和流出道发育异常情况。这一时段与斑马鱼胚胎发育的原肠胚期(5.25～10 hpf)大致吻合。在原肠胚期,位于外、中、内胚层的细胞开始向特定的组织分化,是心脏发育早期的重要阶段,此时期外源性因素可对心脏发育产生较大影响。这提示在胚胎心脏形成和分化的关键时期给予外源性叶酸可以最佳程度上预防乙醇所致的心脏和流出道发育异常。另外，乙醇处理组胚胎予以叶酸后,bmp2b以及tbx1的表达水平较乙醇处理组增高,提示叶酸可能通过影响bmp2b以及tbx1的表达而挽救乙醇处理组胚胎心脏和流出道发育异常。

本研究利用模式生物斑马鱼,围绕乙醇对胚胎心血管系统发育的干扰作用以及叶酸挽救效应开展研究,结果发现乙醇在胚胎发育早期可导致显著心脏和流出道发育异常,在胚胎发育早期7～12 hpf予以叶酸挽救可达到最佳效果,其挽救机制可能与bmp2b和tbx1的表达水平上调有关。本研究旨在为乙醇导致先天性心脏病的机制研究提供线索,也期望为由于母亲孕期乙醇摄入过量而导致胎儿先天性心脏病的有效早期预防和治疗提供依据。

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The folic acid rescue of ethanol-induced heart and outflow tract malformations in zebrafish

SUN Shu-na1,2,YAO Ze-zhong2,JIANG Qiu3,GUI Yong-hao1△

(1DepartmentofCardiology,Children′sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China;2DepartmentofPediatrics,CentralHospitalofMinhangDistrict,Shanghai201199,China;3ShanghaiInstituteofCardiovascularDiseases,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe ethanol-induced cardiac phenotypes and identify ethanol-sensitive stages during embryonic development,and to explore the optimal period during which the administration of folic acid can effectively rescue the ethanol-induced heart and outflow tract (OFT) defects and its underlying mechanisms.MethodsEthanol was administrated to zebrafish embryos in a series of developmental stages (7-12 h) and the abnormal heart and OFT phenotypes were observed after ethanol exposure.The embryos which were given ethanol at 7-12 hpf was defined as ethanol treated group.Administrating folic acid to ethanol-treated zebrafish embryos in different stages (7-12 h) was conducted to rescue the abnormal cardiac defects.The ethanol-treated embryos which were given folic acid at 7-12 hpf was defined as folic acid rescue group.The survival percentage,the malformation percentage,the heart rate and the ventricular shortening fraction (VSF) were recorded.The OFT phenotypes were evaluated using fluorescein micro-angiography.Whole-mount in situ hybridization and Real-time PCR were conducted to analyze the expression of bmp2b and tbx1.ResultsEthanol exposure produced heart and OFT defects,including the abnormal cardiac shapes,the hypogenesis of OFT and the reduced heart rate and VSF.The teratogenic effect of ethanol was observed most obviously at the early embryonic development.Supplementation of folic acid at 7-12 hours post-fertilization partially rescued the developmental defects in ethanol-induced zebrafish embryos.The expressions of bmp2b and tbx1 were reduced in ethanol-treated group,and they were partially recovered after administration of folic acid.ConclusionsFolic acid supplementation can effectively rescue ethanol-induced heart OFT defects,possibly by enhancing the expressions of bmp2b and tbx1.

【Key words】folic acid;ethanol;heart;outflow tract;zebrafish;bmp2b;tbx1

(收稿日期:2015-11-08;编辑:张秀峰)

【中图分类号】R725.4,R394.1

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.002

上海市卫生局青年科研基金(20124y086);上海市出生缺陷防治重点实验室开放课题

△Corresponding authorE-mail:yhgui@shmu.edu.cn