乙肝相关性肝癌组织中HBx和CEACAM1的表达水平及意义

王宏利，沙小莹，郭雅玲，张新昀,罗改云

(西安市第八医院 肝病6科,陕西 西安710061)



乙肝相关性肝癌组织中HBx和CEACAM1的表达水平及意义

王宏利，沙小莹，郭雅玲，张新昀,罗改云

(西安市第八医院 肝病6科,陕西 西安710061)

摘要：目的研究HBx和CEACAM1在乙肝相关性肝癌组织中的表达水平，以期为肝癌发病机制提供新的理论依据和防治策略。方法收集本院血清乙肝病毒表面抗原(HBVsAg)阳性的原发性肝癌患者癌组织标本80例，采用免疫组化法检测HBx和CEACAM1的表达水平；采用Western blot和RT-PCR检测转染乙肝病毒(HBV)X基因的人肝细胞株(PcDNA3-X/HL-7702细胞)、转染空质粒的人肝细胞株(PcDNA3/HL-7702细胞)及未表达乙肝病毒(HBV)X基因的人肝细胞株(HL-7702细胞)中HBx和CEACAM1的表达水平。结果HBx和CEACAM1表达呈负相关，两者的相关系数为-0.248；PcDNA3-X/HL-7702细胞中CEACAM1基因mRNA的相对表达量明显低于HL-7702细胞和 PcDNA3/HL-7702细胞(P=0.000)。结论HBx能够通过抑制CEACAM1的表达，促进肝癌细胞的发生。

关键词：HBx；CEACAM1；乙肝相关性肝癌组织；表达

(ChinJLabDiagn,2016,20:0384)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)在世界范围内传播，据估计全球HBV感染者及携带者达3.5亿之多，其中约有1.3亿人在我国。全国每年约有30万人死于慢性肝病，因肝癌死亡的约有18万人，肝癌在我国恶性肿瘤发病率中排第3位。在诱发肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的众多因素中，HBV感染占80%以上。根据流行病学调查发现，慢性HBV感染者中HCC发生的高危性比非HBV感染者高约200倍。随着对HBV和原发性肝细胞癌的深入研究，人们发现HBV中的x基因表达产物HBx在肝癌形成过程中起着关键的作用。癌胚抗原相关细胞粘附分子l(CEACAMl)是癌胚抗原(CEA)超家族成员。在一些免疫细胞及上皮细胞中均可以检测到CEACAM1的表达。有研究发现,CEACAM1在不同的恶性肿瘤类型中发挥着不同的作用。相比于正常组织，CEACAM1在乳腺癌、前列腺癌中表达下降，而在肺腺癌、黑色素瘤中起促癌作用，CEACAM1在肝癌中发挥作用的机制已有较多报道，但国内外鲜有报道CEACAM1在乙肝相关性肝癌组织中与HBx的相关作用机制。本文通过乙肝相关性肝细胞癌组织的病理标本和转染乙肝病毒(HBV)x基因的人肝细胞株两部分试验，检测HBx和CEACAM1的表达水平，分析HBx 和CEACAM1之间表达的相关性，研究HBx和CEACAM1在肝癌发生、发展中的作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1肝癌组织收集本院2012年1月至2014年4月血清乙肝病毒表面抗原(HBVsAg)阳性的原发性肝癌患者癌组织标本80例，均为手术病例，术前未进行化疗、放疗及其他辅助治疗。

1.1.2细胞和质粒肝细胞HL-7702由西安交大医学院毒理学研究室惠赠。空质粒PcDNA3由武汉晶赛生物工程有限公司合成，重组质粒PcDNA3-X/HL-7702细胞及空质粒PcDNA3/HL-7702细胞由本研究室构建并保存。

1.1.3主要试剂及抗体免疫组化SP试剂盒( 北京中杉生物技术公司) ，小鼠抗人HBx单克隆抗体( NeoMarkers 公司) ，兔抗人CEACAM1 单克隆抗体( 美国Epitomics 公司)，辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔二抗(北京中杉金桥公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥公司)；DMEM 培养基、胎牛血清(Hyclone 公司)、G418培养基、PBS溶液、RNA 提取试剂盒(华美公司)，Trizol试剂(美国 Invitrogen 公司)，XhoI、HindIII 内切酶(TaKaRa 公司)，2*Taq PCR Master(北京天根生物有限责任公司)，TaqDNA聚合酶(美国Promega公司)，RT-PCR试剂盒(TaKaRa 公司)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)；小鼠抗β-actin mAb 及蛋白Marker( Sigma)， PVDF膜(美国Millipore公司)，ECL化学发光试剂盒(北京碧云天公司)，5xTBE缓冲液(鼎国昌盛生物技术公司)，5xloading buffer(南京凯基生物有限公百)，其余试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1免疫组化法标本经甲醛固定，石蜡包埋并烘干后，利用SP法检测，按试剂盒说明书步骤进行，以PBS溶液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照。免疫组化反应物阳性仅表现细胞核着蓝色者为阴性，胞膜、胞质或胞核呈棕黄色者为阳性。标本经免疫组化法检测HBx和CEACAM1表达后阳性标准参考刘凯歌等实验的阳性标准[1]。

1.2.2细胞的培养培养HL-7702细胞采用DMEM培养基,含有10%胎牛血清。培养cDNA3-X/HL-7702 细胞、PcDNA3/HL-7702细胞含有200 μg/ml G418的DMEM细胞培养液(混合有10%的胎牛血清),在37℃孵箱5% CO2条件下培养,根据细胞生长情况,2-3天换细胞培养液1次。

1.2.3RT-PCR(1)RNA的提取[2]：参考孙长宇实验中的RNA提取方法，即通过裂解细胞、抽提蛋白、沉淀RNA、洗涤和重悬等步骤提取RNA。重悬干燥后的RNA低温保存用于RT-PCR。(2)逆转录PCR：按 TaKaRa 试剂盒说明书操作步骤进行。用TaKaRa公司的反转录试剂盒反转录成cDNA,以lug的总RNA为模板,oligo(dT)15为引物,总反应体积为20 μl。结束反应后,将反转录得到的3种细胞cDNA样品各1 μl进行PCR扩增。(3)RT-QPCR：取肝细胞HL-7702、重组质粒PcDNA3-X/HL-7702细胞、空质粒PcDNA3/HL-7702细胞3种细胞cDNA各1 μl作模板,采用PCR法检测HBx和CEACAM1基因外显子mRNA表达水平。

本研究参考朱健康的实验，采用SYBR Green I的检测模式进行荧光定量。PCR反应条件为95℃变性10分钟,循环参数:95℃变性15 s,60℃退火30 s,2℃延伸1 min,扩增30个循环,72℃延伸10分钟。反应结束后确定每组的Ct值(cycle threshold),与本组的内参照β-actin的Ct值比较后,可获得各种检测基因的相对表达量。检测所用的引物序列见表1。

表1　检测所用的引物序列

1.2.4Western blotting检测法[3]：用Western blotting检测肝细胞HL-7702、重组质粒PcDNA3-X/HL-7702细胞、空质粒PcDNA3/HL-7702细胞3种细胞X蛋白和CEACAM1蛋白表达水平差异，以小鼠抗人HBx单克隆抗体，兔抗人CEACAM1 单克隆抗体为一抗，取内参为GADPH,以辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔二抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗为二抗。参考申利红的实验，通过总蛋白的提取、SDS-PAGE胶制备、上样、电泳、转膜、封闭、一抗反应、二抗反应和ECL曝光等步骤进行Western blotting检测。

1.3统计学方法

实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析，采用χ2检验评价HBx和CEACAM1表达的相关性及HBx和CEACAM1表达与患者病理学特征的相关性。计量资料采用t检验，P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1在乙肝相关性肝癌组织中HBx和CEACAM1的表达

采用免疫组化法检测80例乙肝相关性肝癌患者癌组织中HBx和CEACAM1蛋白的表达水平(图1和图2)，HBx表达阳性率为72.50%(58/80)，CEACAM1表达阳性率为67.50%(54/80)；HBx表达阳性者中CEACAM1表达阳性35例，HBx表达阴性者中CEACAM1表达阳性19例，经统计学检验，HBx和CEACAM1表达呈负相关，两者的相关系数r为-0.248(P<0.05)，见表2。

图1乙肝相关性肝癌中CEACAM1阳性表达(SP法×400)图2乙肝相关性肝癌中HBx阳性表达(SP法×400)

表2　CEACAM1和HBx表达的相关性

2.2HBx和CEACAM1的表达与乙肝相关性肝癌临床病理特征关系

HBx和CEACAM1的表达均与最大肿瘤直径、血管侵袭、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05),与性别、年龄不甚相关，此外，HBx还与肿瘤数目(单发、多发)有关(P<0.05)，见表3。

2.3RT-PCR检测3种细胞HBx和CEACAM1基因外显子mRNA表达水平

以β-actin为内参，获得各基因的表达水平，结果显示，PcDNA3-X/HL-7702细胞中HBx基因mRNA的相对表达量明显高于HL-7702细胞和 PcDNA3/HL-7702细胞(P=0.000)，CEACAM1基因mRNA的相对表达量明显低于HL-7702细胞和 PcDNA3/HL-7702细胞(P=0.000)，HL-7702细胞和 PcDNA3/HL-7702细胞中HBx和CEACAM1基因外显子mRNA相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表3　HBx和CEACAM1的表达与乙肝相关性肝癌临床病理特征关系

“*”P<0.05；r为相关系数。

表4　三种细胞中HBx和CEACAM1基因外显子mRNA相对表达量平均值

2.4Western blotting检测3种细胞x蛋白和CEACAM1蛋白的表达

PcDNA3-X/HL-7702细胞中出现HBx蛋白，HL-7702细胞和 PcDNA3/HL-7702细胞中无HBx蛋白形成。PcDNA3-X/HL-7702细胞中CEACAM1蛋白灰度明显低于HL-7702细胞和 PcDNA3/HL-7702细胞，见图3、图4。其中1为PcDNA3-X/HL-7702细胞组，2为PcDNA3/HL-7702细胞组，3为HL-7702细胞组。

3讨论

HBV的x基因是HBV基因组4个开放读码框中的最小一段，其表达蛋白HBx含有154个氨基酸，分子量为17 kD，HBx具有广泛的转录激活功能和非特异性反式激活作用。在细胞核内， HBx可能通过蛋白—蛋白间的相互作用与转录因子和转录元件结合，介导转录起始复合物的形成，直接或间接作用于基因启动子或增强子。研究表明，除此之外，HBx还有反式抑制作用。细胞癌变的基本特征是细胞调节紊乱，造成促进细胞生长因素和诱导细胞死亡因素之间的失平衡。近年来，越来越多的证据表明HBx可以与肝细胞核内外的大量蛋白分子发生相互作用，造成肝细胞调节紊乱，包括影响癌基因、抑癌基因的表达及活性，最终导致肝细胞癌变。

图3　Western blotting检测细胞中HBx蛋白表达

图4　Western blotting检测细胞中CEACAM1蛋白表达

癌胚抗原相关细胞黏附分子 1(CEACAMl)是一种跨膜糖蛋白,被认为是癌胚抗原(CEA)家族成员之一,属于免疫球蛋白超家族。近年来研究表明，CEACAM1在不同的肿瘤中发挥的作用不同，在某些肿瘤中起抑制作用，而在另外一些肿瘤中起促进作用。也有研究发现，CEACAM1可分为胞浆CEACAM1和胞膜CEACAM1[4]，认为其中胞膜CEACAM1具有抑制癌症的作用，而胞浆CEACAM1则具有促进肿瘤发生与发展的作用，解释了CEACAM1在不同肿瘤中表达水平的差异在于胞膜CEACAM1和胞浆CEACAM1的相对多少。

本研究结果表明，在80例乙肝相关性肝癌组织中，HBx与CEACAM1呈负相关(r=-0.248，P<0.05)，说明HBx可能是通过抑制胞膜CEACAM1的表达水平，促进肝癌的发生。HBx和CEACAM1的表达均与最大肿瘤直径、血管侵袭、淋巴结转移及TNM分期等肝癌病理学特征有关(P<0.05)，说明二者均与肿瘤的严重程度相关，其中HBx与最大肿瘤直径、血管侵袭、淋巴结转移及TNM分期呈正相关，CEACAM1与最大肿瘤直径及TNM分期呈负相关，但与血管侵袭及淋巴结转移呈正相关，表明HBx为肿瘤促进因子，而CEACAM1作用不确定，有可能为肿瘤抑制因子。本研究通过构建表达乙肝病毒(HBV)x基因的人肝细胞株：构建重组质粒PcDNA3-X，用脂质体转染法将PcDNA3-X及空质粒PcDNA3导入肝细胞HL-7702中G418选择培养，并用RT-PCR和Western blotting进行HBx基因和CEACAM1基因表达检测鉴定。RT-PCR检测结果表明，(HBV)x基因成功转入肝细胞HL-7702中，并稳定表达，而转染后的肝细胞HL-7702中CEACAM1基因表达明显下降，其mRNA的相对表达量明显低于HL-7702细胞和 PcDNA3/HL-7702细胞(P=0.000)；Western blotting检测结果表明，PcDNA3成功导入HL-7702细胞，且在x基因的存在下，CEACAM1蛋白表达明显下降，此结果与免疫组化法得出的结果相一致，进一步证明了HBx抑制CEACAM1的表达。

通过乙肝相关性肝细胞癌组织病理标本和转染乙肝病毒(HBV)X基因的人肝细胞株两部分试验发现，HBx为肿瘤促进因子，CEACAM1在乙肝相关性肝癌中可能作为肿瘤抑制因子， HBx能够抑制CEACAM1的表达，则表明HBx能通过影响抑癌因子的活性来导致癌细胞的发生，这与Feitelson，Sohn等的研究相一致[5-10]。

参考文献：

[1]陈泽惠,陈嘉昌,丁渭,等.血源性乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和艾滋病病毒核酸筛查系统的建立与应用[J].现代生物医学进展,2014,14(2):347.

[2]孙长宇.乙肝病毒X基因在肝细胞癌发生发展中作用及机制[D].河南:郑州大学,2011.

[3]申利红.HBX基因对肝前体细胞增殖凋亡及分化的影响[D].重庆:重庆医科大学,2013.

[4]朱健康.CEAGAM1在原发性肝细胞肝癌中的表达及其作用机制研究[D].山东:山东大学,2012.

[5]吴燕.HBX调控miR-152-wnt-1致肝癌细胞增殖的作用[D].重庆:重庆医科大学,2012.

[6]张小军,石爱平,许宁.癌胚抗原相关细胞黏附分子1在肿瘤发生、发展及转移中作用的研究进展[J].吉林大学学报(医学版),2012,(05):1037.

[7]魏春山.叶下珠及其复方对HBx介导肝癌VEGFR3表达的影响[D].广东:广州中医药大学,2012.

[8]Wang F,Zhou H,Yang Y,et al.Hepatitis B virus X protein promotes the growth of hepatocellular carcinoma by modulation of the Notch signaling pathway[J].Oncol Rep,2012,27(4):1170．

[9]Sapoznik S,Ortenberg R,Schachter J,et al.CEACAM1 in malignant melanoma:a diagnostic and therapeutic target[J].Curr Top Med Chem,2012,12(1):3．

[10]李程.乙型肝炎病毒X抗原表达与肝细胞凋亡的相关性研究[D].山东:山东大学,2013.

Expression level and significance of CEACAM1 and HBx in HBV related liver cancer tissue

WANGHong-li,SHAXiao-ying,GUOYa-ling,etal.

(SixDepartmentofLiverDisease,Xi'anEighthHospital,Xi'an710061，China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression level of HBx and CEACAM1 in HBV related cancer tissue,so as to provide new theoretical basis and prevention strategies for the pathogenesis of liver cancer.Methods80 Cancer tissue samples were collected from 80 patients with primary liver cancer,whose HBV Surface Antigen(HBVsAg)were positive in our hospital.Immunohistochemical methods were used to detect the expression of HBx and CEACAM1 in pathologic specimen of liver Cancer tissue samples.Using Western blot and RT-PCR to detect the expression of HBx and CEACAM1 in the normal human liver cell lines which had no expression of the X gene of hepatitis b virus(HBV)(HL-7702 cells),and the human liver cell lines of transfection the X gene of hepatitis b virus(HBV)(PcDNA3-X/HL-7702 cells)and empty plasmid(PcDNA3/HL-7702 cells).ResultsNegative correlation were found in the expression of HBx and CEACAM1 whose related phi coefficient is-0.248;The relative expression of CEACAM1 mRNA of PcDNA3-X/HL-7702 cells were significantly lower than the amount of the HL-7702 cells and PcDNA3/HL-7702 cells(P=0.000).ConclusionHBx can promote the occurrence of liver cancer by inhibiting the expression of CEACAM1.

Key words:HBx;CEACAM1;HBV related liver cancer tissue;Expression

(收稿日期：2015-03-19)

作者简介：王宏利(1973-)，男， 本科学历，副主任医师，从事乙肝相关肝癌方面的研究。

文献标识码：A

中图分类号：R735.7

文章编号：1007-4287(2016)03-0384-05

基金项目：陕西省科学技术研究发展计划项目(2014K11-01-01-15)