蜂胶中四环素族药物残留检测方法研究

朱文君，张晓燕，吴斌，沈崇钰，丁涛，陈惠兰（江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，江苏南京210001）



蜂胶中四环素族药物残留检测方法研究

朱文君，张晓燕，吴斌，沈崇钰，丁涛，陈惠兰
（江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，江苏南京210001）

摘要：蜂产品中四环素类药物的检测技术日趋成熟，蜂胶作为蜂产品的重要组成部分，其抗生素的检测方法有待进一步的研究和发展。通过分析比较提取液、内标的选择对试验结果的影响，确定试验方法的线性范围和定量限，建立的高效液相-质谱联用法，回收率在74.1 %到118.8 %之间，精密度在15 %以下，能够满足蜂胶产品中四环素药物残留的日常检测。

关键词：蜂胶；四环素族药物；液相色谱质谱联用

蜂产品包括蜂蜜、蜂胶、蜂花粉、蜂蜡、蜂王浆等几类[1]，蜂胶是工蜂从植物体上采集的树脂与上颚腺的分泌物和蜂蜡等形成的胶状混合物，主要用于涂抹蜂巢裂缝和防止蜂巢内的尸体腐烂，是蜜蜂用于维护群体健康的有效物质，被誉为“紫色黄金”，具有抗菌消炎、免疫调节、抗氧化、加速组织愈合的作用，同时可用于高脂血症和糖尿病的辅助治疗。因其特殊的医疗保健功能，蜂胶越来越受到食品、保健品、化妆品、医药行业及广大消费者的关注[2-3]。

四环素族抗生素（Tetracyclines，TC s）是最早用于治疗美洲腐臭幼虫病的抗生素之一，目前常用的主要包括四环素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）、金霉素（Chlortetracycline，CTC）等[4-5]，在养蜂过程中休药期不够长以及药物用量较大等会引起四环素族药物在蜂产品中残留。由于TCs易在骨骼和牙齿中沉积，导致牙齿持久染色（四环素牙）；也可在肝组织中富集，造成肝损害，特别是其结构中含有多个活性基团，可以与蛋白质结合，从而导致耐药菌株的产生。

目前关于蜂蜜和蜂王浆等两种蜂产品中四环素族抗生素检测方法的报道比较多，目前的检测方法有酶联免疫法[6]、毛细管电泳法、薄层色谱法、液相色谱法[7]和液相色谱-串联质谱法[8-10]。酶联免疫试剂盒适用于大批量样品的筛查，但存在假阳性无法进行确证的问题。由于液相色谱串联质谱法抗干扰能力强，前处理也简单，已成为检测蜂蜜、蜂王浆中四环素族药物最常见的方法。我国关于蜂胶中兽药残留检测的文献较少，远不足以保障蜂胶的食用安全性。因此，迫切需要建立蜂胶中四环素族抗生素检测方法。

1　材料与方法

1.1仪器和设备

Thermo Finnigan Surveyor液相色谱系统和TSQVantage串联四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源（Electron Spray Ionization，ESI）；2-16PK离心机：德国Sigma公司；N-EVAPTM111氮吹仪：美国Organomation Associates公司；超纯水器：MILLIPORE公司；固相萃取柱OASIS HLB 3 mL/60 mg。

1.2试剂与溶液

甲醇、乙腈（色谱纯）：德国Merck公司；甲酸（色谱纯）：德国CNW公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠（分析纯）：南京化学试剂厂；四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、地美环素和甲烯土霉素标准品（纯度≥95 %）：Dr. Ehrenstorfer。

Mcllvaine缓冲溶液（0.1 mol/L）：称取21.0 g柠檬酸，用水溶解并稀释至1 000 mL混匀；称取28.4 g磷酸氢二钠，用水溶解并稀释至1 000 mL混匀；将1 000 mL上述柠檬酸溶液与625 mL磷酸氢二钠溶液混合，必要时用氢氧化钠调节pH＝4.0±0.05；准确称取60.5 g的乙二胺四乙酸二钠加入缓冲溶液中使其溶解摇匀。

1.3标准溶液的配制

1.3.1标准储备液

称取四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、地美环素和甲烯土霉素标准品，分别用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L标准储备液，于0℃～4℃保存。

1.3.2工作储备液

准确吸取一定量四环素、土霉素、金霉素和强力霉素1.0 g/L标准储备液用乙腈-水（1∶1，体积比）逐级稀释到1.0 μg/mL混合工作溶液，于0℃～4℃保存；准确吸取一定量地美环素和甲烯土霉素1.0 g/L标准储备液用乙腈-水（1∶1，体积比）稀释到1.0 μg/mL作为内标溶液，于0℃～4℃保存。

1.3.3标准曲线的制作

吸取50 μL内标溶液及一定量的1.0 μg/mL混合工作溶液，配成2、5、10、20、50、100.0 ng/mL系列标准溶液。

1.4仪器及色谱——质谱条件

HPLC条件：Agilent Polaris C-18色谱柱（100 mm× 2.0 mm，5 μm）；流动相：A. 0.1 %甲酸水溶液，B.甲醇；梯度洗脱程序：0～1.0 min10 %B，3.0 min～4.0 min，30 % B；6.0 min～9.0 min 90 %B，9.1 min～11.0 min 10 %B；流速：0.25 mL/min；柱温为室温，进样体积为25 μL。

MS/MS条件：采用ESI源，正离子方式检测；离子源温度：350℃；喷射电压：2 500 V；鞘气（Sheath Gas）55 arb，辅助气（Auxiliary Gas）10arb；其他质谱条件见表1。

表1目标物及内标的质谱条件Table 1 MS/MS parameters of object and internal standard

1.5方法

1.5.1样品提取方法

称取（1+0.05）g待测蜂胶样品于50 mL塑料离心管中，加入50 μL美他环素、地美环素混标做内标，加入四环素类混标溶液做外标，加入15 mL Mcllvaine缓冲液，分别在涡旋混匀器快速混匀2 min，高速离心，上清液过滤至玻璃管中。

1.5.2样品纯化方法

取Oasis HLB柱，常压条件下首先用3 mL甲醇活化，待柱内甲醇流干之后，用3 mL去离子水洗涤，去离子水流干后，将玻璃管中的经过滤的均匀溶样液加到柱内，待测溶液完全流过Oasis HLB后，用5 mL去离子水洗柱，弃去全部流出液，在65 kPa的负压下，减压抽干10 min，最后用5 mL甲醇溶液洗脱。收集洗脱液于10 mL试管中。于40℃水溶液中氮气吹至近干。试管从氮吹装置取出后，用1 000 μL甲醇水（甲醇与水的体积比为3∶7）溶液溶解。样液经过0.45 μm的有机滤膜后，上液相色谱质谱仪测定。

2　结果与讨论

2.1样品中四环素类抗生素提取液的选择

四环素类抗生素在弱酸性溶液中相对稳定，在酸性（pH＜2）、中性或碱性（pH≥7）条件下易发生降解，所以比较不同pH缓冲液的提取效果，主要选择Mcllvaine缓冲溶液（pH4）、磷酸盐缓冲液（pH5）和磷酸盐缓冲液（pH6），由于四环素类抗生素容易与Ca2+、Mg2+、Fe2+等金属离子发生螯合，所以在3种提取液中均加入了EDTA。在试验过程中发现，随着pH上升，蜂胶粉经提取后得到的提取液颜色也逐渐加深，4种化合物的回收率见图1。由图1可知，采用Mcllvaine缓冲溶液时4种目标物的回收率最高，所以选择了Mcllvaine缓冲溶液作为提取液。

2.2内标的选择

4种目标物与2种内标的色谱出峰时间及相对丰度见图2。

图1不同pH提取液的回收率Fig.1 Recovery of the different pH

图2（a）标准溶液色谱图；（b）蜂胶加标样品色谱图Fig.2（a）Chromatorams of standard solution；（b）Chromatorams of propolis spiked

由图2可以看出，四环素类抗生素的绝对回收率为20 %～50 %，表明在前处理过程中有部分损失，而引入同位素内标是校正前处理损失的较好选择。由于常用四环素族药物主要是由不同链霉菌的培养液中提取获得或者是再经过半合成得到的，目前尚没有同位素内标，所以采用结构及性质类似的物质作为内标。试验发现，以地美环素作为金霉素和强力霉素的内标，以甲烯土霉素作为四环素和土霉素的内标，均可以使目标化合物获得满意的回收率。

2.3方法的线性范围和定量限

配制质量浓度为10 μg/L～200 μg/L的系列标准溶液，以目标物与内标的峰面积比值（y）为纵坐标，目标物的质量浓度（x，μg/kg）为横坐标进行线性回归，线性方程及相关系数见表2。

表2四环素、土霉素、金霉素及强力霉素的线性方程及相关系数Table 2 Linear equation and correlation coefficient

在蜂胶粉样品中添加四环素族药物标准溶液，按照1.4的方法进行前处理，并对试验结果进行分析，确定方法的定量限为20 μg/kg。

2.4回收率的结果分析

选取阴性蜂胶样品，添加4种四环素族化合物标准品，添加水平分别为20、40和100 μg/kg，每个水平做6个平行，用内标法定量，结果见表3。

表3回收率和精密度数据（n=6）Table 3 Recovery and precision（n=6）

可以看出，方法的平均回收率在74.1 %到118.8 %之间，精密度在15 %以下，满足日常分析的需要。

3　结论

试验建立一种检测蜂胶中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素的液质联用新方法。采用Mcllvaine缓冲溶液提取蜂胶中的四环素残留，以结构和性质相似的地美环素和甲烯土霉素作为4种四环素类目标物的内标，确定了试验方法的线性范围和定量限。试验结果显示，平均回收率在74.1 %到118.8 %之间，精密度在15 %以下，重现性好。该试验方法可以满足蜂胶产品中四环素类药物残留的日常检测工作。

参考文献：

[1]周枫.蜂产品中抗生素残留检测方法研究进展[J].信阳农业高等专科学校,2010,20(2):132-134

[2]袁军,刘玉萍,陈广全.蜂胶中四环素抗生素残留的测定[J].现代商检科技,1998,8(3):21-23

[3]张翠平,胡福良.2008～2009年国内外蜂胶研究概况[J].中国蜂业, 2010,61(4):35-38

[4]魏小琴,刘忠芳,刘绍璞.四环素类抗生素-钨酸钠-乙基紫体系的共振瑞利散射光谱及其分析[J].应用化学学报, 2006,64(6): 521-526

[5]胡佶,王江涛.四环素在海洋沉积物上的吸附[J].高等学校化学学报,2010,31(2):320-324

[6]赵思俊,郑增忍,曲志娜,等.免疫亲和色谱-HPLC-FLD法测定动物肝脏中10种喹诺酮类药物残留[J].分析化学研究报告,2009, 37(3):335-340

[7]高红,赵一兵,郭祥群.一种测定四环素类抗生素的光谱新方法[J].光谱学与光谱分析, 2006,26(3):488-490

[8]郭少飞,王鹏,荆涛,等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂蜜中甲硝唑、二甲硝咪唑和洛硝哒唑残留[J].华中科技大学学报, 2008,37(6):830-833

[9]冯雷,张学忠,牛之瑞,等.超高效液相色谱-串联质谱法检测蜂蜜中氯霉素残留[J].食品研究与开发,2010,31(12):181-184

[10]周萍,胡福良,龚珊,等.液液萃取法结合高效液相色谱—串联质谱测定蜂王浆中的氯霉素残留量[J].食品科学,2008,29(5):341-343

Researches of Detection for Tetracycline Drugs in Propolis

ZHU Wen-jun，ZHANG Xiao-yan，WU Bin，SHEN Chong-yu，DING Tao，CHEN Hui-lan
（National Honey Reference Laboratory，Animal，Plant and Food Inspection Center（APFIC）of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，Jiangsu，China）

Abstract：The detection technology of tetracycline drugs in bee products has become mature increasingly. As an important part of bee products，the analytical method in propolis needs to be developed and researched. In this article，we choose different extract and internal standard，the experimental results are different. A linear range and quantitative restrictions were determined by the experiment. The recovery rate was between 74.1 % to 118.8 %，the precision of under 15 %.By high performance liquid chromalogphy-tandem mass spechomethy，the detection of tetracycline drugs residues can be satisfied in propolis.

Key words：propolis；tetracycline drugs；liquid-mass spectrometry

收稿日期：2014-09-28

作者简介：朱文君（1986—），女（汉），工程师，硕士，主要从事蜂产品中兽药残留的检测工作。

基金项目：国家质检总局科研基金项目（2012IK167）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.035