玛咖石油醚提取物抗疲劳的影响及组分分析

杨秦，吕学远，代鹏飞，余龙江，金文闻，*（.华中科技大学生命科学与技术学院，资源生物学与生物技术研究所，湖北武汉40074；2.华中师范大学体育学院，湖北武汉40079；.武汉华士特工业生物技术开发有限公司，湖北武汉40074）



玛咖石油醚提取物抗疲劳的影响及组分分析

杨秦1，2，吕学远1，代鹏飞3，余龙江1，金文闻1，*
（1.华中科技大学生命科学与技术学院，资源生物学与生物技术研究所，湖北武汉430074；2.华中师范大学体育学院，湖北武汉430079；3.武汉华士特工业生物技术开发有限公司，湖北武汉430074）

摘要：利用长时间游泳制备小鼠运动疲劳模型，探讨玛咖石油醚提取物对抗运动性疲劳的功效及可能机制。结果显示，补充玛咖石油醚提取物可以显著延长负重力竭游泳时间，显著降低血乳酸、血氨和血乳酸脱氢酶，增加非酯化脂肪酸和肝糖原含量，而血尿素氮和血糖无显著性差异。高效液相色谱和气相色谱-质谱分析显示玛咖石油醚提取物含有脂肪酸和约20%玛咖酰胺。

关键词：玛咖；石油醚提取物；抗疲劳；能量代谢

运动性疲劳是体内一个复杂的生理生化变化过程，代谢失调能导致疲劳的产生[1]。代谢失调包括能源物质的消耗如糖原和葡萄糖，以及代谢产物的积累如乳酸、尿素氮、氨等[2]。有很多方法可以缓解疲劳，而补充无毒副作用的天然活性物质是营养学家、运动生理学家不断寻找的缓解运动性疲劳的方法之一。

玛咖（Lepidium meyenii Walp.），是一种药食两用植物，属于十字花科，生长在3 500 m的高寒地区[3]。玛咖具有很多药理活性，如增加生育率、增强性欲、提高精力等。已有研究发现二氧化碳超临界流萃取的玛咖脂溶性物质能显著提高负重游泳小鼠的力竭游泳时间[4]。本试验研究石油醚提取的玛咖脂溶性成分抗运动性疲劳的功效及可能机制，并用高效液相色谱仪和气相色谱-质谱仪分析了石油醚提取物中的脂溶性成分，以期为抗疲劳天然产品的开发找到参考。

1　材料与方法

1.1试剂

玛咖：丽江百岁坊生物科技开发有限公司；玛咖酰胺标准品：武汉华士特工业生物技术开发有限公司；石油醚、甲醇、正己烷、吐温-80、氯化钠、氢氧化钾、三氟化硼、乙醚：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇：色谱纯，Tedia公司；血乳酸、血氨、血乳酸脱氢酶、非酯化脂肪酸、糖原、血尿素氮、血糖试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2实验动物

Balb/c小鼠由湖北省实验动物研究中心提供。5周龄雄性小鼠在动物饲养笼中饲养，室内灯光12 h明暗交替，室温为（23±1）℃。在试验期间，所有小鼠允许自由摄取啮齿类动物饲料和蒸馏水。

1.3仪器与设备

1200型高效液相色谱仪：安捷伦科技公司；5975C型气相色谱-质谱仪：安捷伦科技公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；SB-5200DT超声波清洗仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-1600紫外分光光度仪：上海美谱达仪器有限公司；GL-21M高速冷冻离心机：湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；三用电热恒温水箱：天津市泰斯特仪器有限公司；AE100分析天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；YP202N电子天平：上海精密科学仪器有限公司。

1.4方法

1.4.1玛咖石油醚提取物的制备

玛咖根被洗净并切成薄片，干燥处理后，用粉碎机粉碎并过80目筛。干燥的玛咖粉用12倍体积石油醚50℃磁力搅拌回流提取30 min，再超声提取15 min，减压抽滤得到上清液。再重复一次以上步骤，合并抽滤的上清液，并用旋转蒸发仪在48℃～52℃下真空浓缩。临用前，将浓缩后的提取物用1 %吐温-80超声溶解，放于4℃冰箱备用。

1.4.2动物分组与给药

小鼠适应性喂养3 d后，适应性游泳10 min，淘汰不能游泳的小鼠，第4天进行负重5 %力竭游泳实验，记录力竭游泳时间，根据小鼠的游泳能力和体重进行分组。小鼠被分为3组，每组10只，分别是空白对照组、玛咖石油醚提取物低剂量组（60 mg/kg·bw）和石油醚提取物高剂量组（200 mg/kg·bw）。实验剂量的选择根据前期预实验结果设置。小鼠灌胃剂量为每天0.2 mL/10 g，连续灌胃21 d，空白对照组灌胃相同体积的溶媒。

1.4.3负重游泳能力测试

小鼠每周游泳2次，每次10 min，以习惯游泳。实验第14天，小鼠灌胃30 min后进行负重游泳实验，记录力竭游泳时间。负重游泳实验用来评估小鼠的耐力表现，实验方法参照文献[5]，略有改动。具体如下：灌胃30 min后，小鼠被放置到塑料池（80 cm×45 cm× 40 cm）中游泳，池水深度为35 cm，水温为（27±1）℃。距离小鼠尾根部1 cm处负体重5 %的铅皮。小鼠沉在水下10 s不能浮出水面用鼻子呼吸被认为达到力竭状态，迅速将其捞起，并记录力竭游泳时间。

1.4.4血液的采集及生化指标的测定

负重游泳实验结束，小鼠继续灌胃7 d，实验第21天灌胃30 min后，小鼠游泳90 min。游泳结束后，立即拔除小鼠眼球，血液从眼球后的血管丛收集。血样静置半小时后，4℃下3 000 r/min离心10 min，取上清，并储存在-80℃超低温冰箱备用。血乳酸（LD）、血氨（BA）、血乳酸脱氢酶（LDH）、非酯化脂肪酸（NEFA）、肝糖原（LG）、血尿素氮（BUN）、血糖等指标用试剂盒进行测定。

1.4.5玛咖石油醚提取物脂肪酸种类检测

玛咖石油醚提取物甲酯化后，用正己烷溶解。用气相色谱-质谱仪（GC-MS）分析样品，色谱柱为HP-5MS柱（30 m×250 μm×0.25 μm，安捷伦科技公司）。进样量为0.2 μL，流速为1 mL/min，检测器温度为230℃。升温程序是160℃保持2 min，然后以4℃/min升温到180℃保持4 min，然后以10℃/min升温到300℃保持5 min。

1.4.6玛咖石油醚提取物中玛咖酰胺的含量分析

高效液相色谱（HPLC）分析参考McCollom等[6]研究方法略作改动，简要如下：将玛咖脂溶性成分溶于甲醇，过0.45 μm滤膜，色谱柱为TC-C18柱（250 mm× 4.6 mm×5 μm，安捷伦科技公司），流动相为90 %乙腈，流速为0.6 mL/min，进样量为20 μL。检测波长为210 nm，室温下操作。

1.5数据处理与分析

试验数据采用SPSS17.0统计软件进行统计分析处理，所有数据用平均值±标准偏差表示。数据用单因素方差分析，组间用LSD-t检验比较。P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01具有极显著差异。

2　结果与分析

2.1对小鼠负重游泳力竭时间的影响

玛咖石油醚提取物补充对小鼠力竭游泳时间的影响见图1。

图1玛咖石油醚提取物补充对小鼠力竭游泳时间的影响Fig.1 Effects of maca-petroleum ether extract on the swimming time to exhaustion of weight-loaded mice

空白对照组、玛咖石油醚提取物低浓度和高浓度补充组的力竭游泳时间分别是（8.92±1.15）、（12.15±2.78）、（14.16±4.89）min。低浓度和高浓度补充组的力竭游泳时间比对照组各增加了36 %和59 %，具有显著性差异（P < 0.05）。

2.2对小鼠体重的影响

记录实验前体重（始重）、实验第7天（中重）和第14天（终重）的体重。玛咖石油醚提取物对小鼠体重的影响见表1，与对照组相比，小鼠体重无显著性差异。

表1玛咖石油醚提取物补充对小鼠体重的影响Table 1 Effects of maca-petroleum ether extract on body weights in mice

2.3对血液指标和糖原含量的影响

玛咖石油醚提取物对血清参数和糖原含量的影响见表2。

表2玛咖石油醚提取物对血清参数和糖原的影响Table 2 Effect of maca-petroleum ether extract on serum parameters and glycogen storage in mice

与对照组比较，玛咖石油醚提取物高低剂量组的肝糖原（LG）显著增加（P < 0.05），非酯化脂肪酸（NEFA）浓度显著降低（P < 0.05）。与对照组相比，玛咖石油醚提取物高低剂量组血乳酸（LD）和血乳酸脱氢酶（LDH）活力显著降低（P < 0.05），血氨（BA）浓度显著降低（P < 0.05，P < 0.01）。然而血清尿素氮（BUN）和血糖（Glucose）含量各组间没有显著性差异。

2.4玛咖石油醚提取物成分中脂肪酸种类的分析

玛咖石油醚提取物中脂肪酸的种类用气相色谱分析见图2。

图2玛咖石油醚提取物的气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of maca-petroleum ether extract

由此得出玛咖石油醚提取物包含的脂肪酸主要为亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸等。

2.5石油醚提取物中玛咖酰胺的种类和含量分析

石油醚提取物中玛咖酰胺的高效液相色谱分析见图3。

图3玛咖酰胺的高效液相色谱分析，检测波长210 nmFig.3 High Performance Liquid chromatograms of macamides quantified at 210 nm

提取物中玛咖酰胺与混标的保留时间进行比较，其各自含量用标准曲线方程进行计算。结果显示玛咖石油醚提取物含有约20 %玛咖酰胺。其中含量较高的3种玛咖酰胺分别是化合物1为N-苄基亚麻酰胺，占4.22 %；化合物2为N-苄基亚油酰胺，占4.59 %；化合物3为N-苄基棕榈酰胺，占6.63 %。

3　结论与讨论

负重游泳实验是评估体力疲劳程度的经典实验方法。研究结果显示，补充玛咖石油醚提取物能显著延长小鼠负重游泳时间，提示玛咖石油醚提取物具有抗运动性疲劳效果。此外，玛咖石油醚提取物中含有脂肪酸和20 %玛咖酰胺，主要包含苄基棕榈酰胺、苄基亚油酰胺和苄基亚麻酰胺。

身体的运动耐力依赖于包括糖原在内的能源储存和代谢产物的积累[7]。在运动过程中，糖原作为重要的能源物质用于补充血糖的消耗，保持血糖在生理范围内。增加糖原的消耗与运动疲劳的产生有一定关联[8]。另一方面，在运动中增加脂肪酸的利用，可以减少糖原的消耗，增加耐力运动表现[9]。非酯化脂肪酸含量的增加被认为是肌肉中脂肪代谢的增强的原因[10]。研究结果显示灌胃石油醚提取物小鼠的肝糖原（LG）和非酯化脂肪酸（NEFA）含量较对照组显著增加（P < 0.05），而血糖水平无明显变化。该结果提示玛咖石油醚提取物提高运动耐力可能是因为增加脂肪的利用而减少了糖原的消耗。乳酸等代谢产物的积累是引起机体疲劳的又一原因[11]。多余的乳酸会引起pH降低，从而抑制肌肉收缩。因此快速消除乳酸对于缓解运动疲劳具有重要意义。研究发现灌胃玛咖石油醚提取物组比对照组的血乳酸含量显著性降低（P <0.05），而乳酸是碳水化合物的代谢产物，乳酸含量的降低与葡萄糖和糖原的利用率降低结果一致。尿素氮（BUN）和氨（BA）是运动中蛋白质和氨基酸降解的产物。研究结果显示玛咖石油醚提取物显著降低BA浓度，而各组间的血清尿素氮（BUN）没有显著差异。血清乳酸脱氢酶（LDH）是肌肉损伤的指标，因为LDH通常存在于肌肉细胞中并作为肌肉损伤的结果被释放到血液中[12]。研究结果显示补充玛咖石油醚提取物的小鼠比对照组的LDH活力更低，意味着补充玛咖石油醚提取物能减轻运动中肌肉的损伤。

综上结果，玛咖石油醚提取物能延长小鼠负重游泳时间，对长时间运动小鼠能增加运动后肝糖原、非酯化脂肪酸含量，降低血乳酸、血氨、血乳酸脱氢酶水平，具有抗运动性疲劳的功效，且此功效可被部分解释为通过转变能量代谢实现的。

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Anti-fatigue Effect of Maca Petroleum Ether Extract and Its Component Analysis

YANG Qin1，2，LÜ Xue-yuan1，DAI Peng-fei3，YU Long-jiang1，JIN Wen-wen1，*
（1. Institute of Resource Biology and Biotechnology，College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，Hubei，China；2. School of Physical Education and Sport，Central China Normal University，Wuhan 430079，Hubei，China；3. Wuhan Huashite Industrial Biotechnology Development Co.，Ltd.，Wuhan 430074，Hubei，China）

Abstract：This study investigated the effects of maca petroleum ether extract（MPE）on exercised-induced fatigue in mice to characterize its effective constituents and anti-fatigue mechanisms. Results suggested that supplementation with MPE could significantly extend the weight-loaded swimming time；reduce the serum lactic acid（LD），blood ammonia（BA），serum lactate dehydrogenase（LDH）；increase the non-esterified fatty acid（NEFA），liver glycogen（LG）levels；nevertheless，the levels of blood urea nitrogen（BUN）and glucose were not significantly different compared with the control group. High Performance Liquid Chromatography（HPLC）and Gas Chromatography-Mass Spectrometer（GC-MS）analysis showed that MPE contained about fatty acids and 20 % macamides.

Key words：maca；petroleum ether extract；anti-fatigue；energy metabolism

收稿日期：2015-04-13

*通信作者：金文闻（1976—），男（回），讲师，博士，研究方向：天然产物化学研究与开发。

作者简介：杨秦（1981—），女（侗），讲师，博士在读，研究方向：天然产物研究与开发。

基金项目：国家基础科学人才培养基金（Grant No.J1103514）；湖北省自然科学基金项目（No.2012FFB02607）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.003