双抗体夹心ELISA法研究rMBP- NAP在大鼠体内的药代动力学

崔明辰，陈娇，时冉冉，王建国

(漯河医学高等专科学校 1.医疗系, 2.生物化学教研室，河南 漯河　462002)



双抗体夹心ELISA法研究rMBP- NAP在大鼠体内的药代动力学

崔明辰1，陈娇2，时冉冉2，王建国

(漯河医学高等专科学校 1.医疗系, 2.生物化学教研室，河南 漯河462002)

[摘要]目的:研究重组麦芽糖结合蛋白- 中性粒细胞激活蛋白(rMBP- NAP )在大鼠体内的药代动力学。方法:给大鼠静脉注射rMBP- NAP后在不同时间点采血，用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)测定rMBP- NAP的血浆浓度，然后用DAS2.1药动学软件进行曲线拟合并计算药代动力学参数。结果:rMBP- NAP静脉给药后迅速入血，2.5、5和10 mg·kg(-1) 3种剂量的消除半衰期分别为1.983、1.747和2.006 h，血浆清除率呈非剂量依赖性改变，血浆药物浓度—时间曲线下面积随着剂量的增加而成比例增加；rMBP- NAP在大鼠体内的分布以肾脏最高，其后为肺和肝，以脑组织中浓度最低。结论:rMBP- NAP给药后能迅速进入血液循环，其消除符合线性动力学特征，rMBP- NAP在大鼠体内的药代动力学过程符合二室开放模型，呈一级动力学消除，给药后主要分布到肾脏。

[关键词]rMBP- NAP； 酶联免疫法； 药代动力学

在肿瘤宿主抗原特异性T细胞的分化过程中，Th2的分化占优势，Th2优势状态与肿瘤的免疫逃逸有密切关系[1- 3]。幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(HP- NAP)是幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.Pylori)的主要毒力因子之一。Amedei等报道，HP- NAP是一种脱氧受体2(Toll- like receptor 2)激动剂，能够诱导人中性粒细胞和单核细胞产生IL- 12和IL- 23等细胞因子，促进树状突细胞(DC)成熟，使宿主抗原特异性CD4+T细胞由Th2向Th1免疫反应转变，产生显著的细胞毒性免疫应答[4]，增强Th1免疫，起到对肿瘤进行免疫治疗的作用。

但是由于H.Pylori体外培养条件苛刻，利用DNA重组技术制备HP- NAP技术成熟且有市场开发价值。我们从H.Pylori临床分离株MEL- HP27中克隆到HP- NAP编码基因HP- napA全长，目前，已经通过基因工程手段对天然序列改造，获得了一组新型重组融合蛋白，经筛选重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinant maltose- binding protein- neutrophil- activa-

ting protein， rMBP- NAP )具有免疫活性[5]。

目前，尚未有关于rMBP- NAP药代动力学的报道，为了确立rMBP- NAP的药代动力学特性以及其药代药效间的关系，本实验欲建立一种双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)，测定融合蛋白rMBP- NAP在对大鼠给药后的药代动力学，以了解其代谢情况，为合理用药提供依据。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

rMBP- NAP[6]、重组谷胱甘肽- 中性粒细胞激活蛋白(GST- NAP)均由本实验室制备，浓度为2 mg·ml-1，纯度96.5%。兔抗NAP多克隆抗体由本实验室制备，浓度为2.5 mg·ml-1，纯度97%；MBP- 标签小鼠单克隆抗体(南京金斯瑞生物科技公司)；Bio Rad 680酶标仪(上海麦莎生物科技有限公司)；Heal Force Neofuge 15R 台式高速冷冻离心机。

1.2动物

清洁级SD大鼠，6～8周龄，雌雄各半，河南省实验动物中心提供，动物合格证号SYXK(豫)2005- 0012。

1.3棋盘滴定法确定抗体夹心ELISA最佳试剂浓度

将捕获抗体(兔NAP多克隆抗体2.5 mg·ml-1)分别稀释成浓度为1︰500、1︰1 000、1︰2 000，包被在ELISA酶标板上，每一浓度包被一横行，4 ℃过夜，洗涤拍干；把强阳性抗原(125 ng·ml-1)与阴性对照液加到同一包被抗体浓度的一列中，温育，洗涤拍干。抗体稀释液将检测抗体(小鼠MBP标签单抗0.5 mg·ml-1)分别稀释成浓度为1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000，加到每一纵行，温育，洗涤拍干；每孔加入1∶25 000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，温育，洗涤拍干显色，读取OD450值。

1.4大鼠血浆中rMBP- NAP检测标准曲线的制备

应用建立的最佳ELISA条件测定不同稀释倍数的rMBP- NAP蛋白(1000、500、250、125、62.5、31.25和15.625 ng·ml-1)，用Origin 8.0软件中的四参数逻辑曲线绘制标准曲线，求得回归方程。

1.5大鼠血浆中rMBP- NAP回收率测定

将大鼠空白血浆配制成含250、62.5、15.625 ng·ml-1的rMBP- NAP，每个样品设6个孔，按夹心ELISA步骤检测，计算出平均回收率。

1.6ELISA法的灵敏度、精密度及特异性

在线性范围内选取选取250、62.5、15.625 ng·ml-13个浓度，与标准曲线同时测定。在同一次实验中每个浓度测6孔，计算批内变异系数；连续测6批，计算批间变异系数。

将rMBP- NAP的结构相似物GST- NAP及标准品rMBP- NAP以相同的终浓度加入到rMBP- NAP中。具体如下:设6个样本孔，加入100 μl rMBP- NAP(终浓度为62.5 ng·ml-1)，另设6个对照孔，加入终体积为100 μl 的rMBP- NAP(终浓度为62.5 ng·ml-1)和GST- NAP(终浓度为也62.5 ng·ml-1)，观察干扰物对rMBP- NAP的测定影响。

1.7rMBP- NAP在大鼠体内的药代动力学研究

选取24只SD大鼠，雌雄各半，随机分成4组，每组6只，参照药效学试验，将rMBP- NAP剂量设为10、5、2.5 mg·kg-1)，另设空白对照组，尾静脉注射给药体积1 ml。给药后0.25、0.5、1、2、 4、6、 8、10 和12 h 从眼眶静脉丛用肝素化的毛细管采血，离心收集血浆，低温保存，待样品准备完后按照优化过的双抗体夹心ELISA方法检测。然后用DAS2.2.1药动学软件进行曲线拟合并计算参数。

1.8rMBP- NAP静脉注射后在大鼠体内的组织分布检测

选取24只大鼠，雌雄各半，随机分成4组，每组6只，其中1组为空白对照组，其余3组按照5 mg·kg-1剂量尾静脉注射给药，体积为1 ml。分别在给药后0.5、2、4 h将大鼠乙醚麻醉处死，迅速取出心、肝、脾、肺、肾以及脑组织，用预冷的PBS冲净组织血液，滤纸吸干后称重，剪碎组织后加入组织重量5倍体积的预冷PBS，用高速匀浆器制成匀浆，以3 000 r·min-1离心10 min后取上清，用PBS稀释不同倍数制成样品，用建立的ELISA法完成测定。

2结果

2.1双抗体夹心ELISA法的建立

棋盘滴定结果显示，兔NAP多克隆抗体滴定浓度为1∶500，小鼠MBP单克隆抗体滴定浓度为1∶1 000处的OD450值在0.8左右，阴性对照的OD450小于0.1，因此，这两种抗体的稀释度选择1∶500和1∶1 000。

2.2双抗体夹心ELISA法标准曲线

双抗体夹心ELISA法标准曲线如图1，标准曲线范围5.625～1 000 ng·ml-1，R2>0.99。

图1双抗体夹心ELISA方法检测重组融合蛋白rMBP- NAP标准曲线

2.3双抗体夹心ELISA法检测rMBP- NAP的回收率

测得 rMBP- NAP在250、62.5、15.625 ng·ml-13种浓度时的回收率见表1， 平均回收率为106%。

表1ELISA法检测rMBP- NAP的回收率

样品序号理论值/ng·ml-1平均值/ng·ml-1标准差SD回收率/%1250260.7315.39104262.564.154.96103315.62517.281.25111

2.4ELISA法检测rMBP- NAP的灵敏度、精密度及特异性

经多次测定， ELISA法最低检测灵敏度为15.625 ng·ml-1。批内及批间变异系数如表2所示，均小于10%，符合精密度的要求。

在加入了结构类似物GST- NAP后，OD450检测值变化很小，与未加结构类似物相比，差异无统计学意义，说明此ELISA方法能特异性检测rMBP- NAP。

表2ELISA法检测rMBP- NAP的批内及批间精密度

理论值/ng·ml-1测定平均值/ng·ml-1标准差SD变异系数CV/%平均变异系数CV/%批内6.95250260.7315.395.9062.564.154.967.7315.6317.281.257.23批间6.93250257.2217.336.7362.564.804.026.2015.6316.391.297.85

表3ELISA法测定rMBP- NAP的特异性

样品孔1OD值孔2OD值孔3OD值孔4OD值孔5OD值孔6OD值平均OD值P值rMBP-NAP61.25ng·ml-10.6070.5480.5350.4560.5380.5360.537加入等浓度GST-NAP0.540.5290.480.510.490.460.500.84

2.5rMBP- NAP静脉给药后大鼠血药浓度及药代动力学参数的变化

图2显示，静脉注射rMBP- NAP后迅速入血，然后慢慢消除，12 h时在血液中仍能被检测到，药代动力学参数如表4。

图2静脉注射给药后大鼠血浆中rMBP- NAP的血药浓度—时间曲线(n=6)

2.6双抗体夹心ELISA法检测大鼠静脉注射融合蛋白rMBP- NAP在组织器官分布

如图3，可见rMBP- NAP进入体内大鼠后，主要分布到肾脏，其次为肝脏。

3讨论

目前临床多使用一种或几种细胞因子来改变T细胞向Th1/Th2漂移，如使用IL- 2、IFN-γ或拮抗剂等[7]。但细胞因子网络复杂，有时单一细胞因子疗效不显著，调节不当甚至有副作用[8]。初步药效学实验表明，重组rMBP- NAP具有提高Th1免疫活性的作用，可开发成为有效的细胞免疫调节剂。

我们采用双抗体夹心ELISA法测定了大鼠血浆中rMBP- NAP的含量，结果表明此方法特异性高、回收率稳定、灵敏度及精密度良好，能够满足测定要求。

本研究结果显示，2.5、5、10 mg·kg-1rMBP- NAP静脉注射后的消除半衰期和血浆清除率呈非剂量依赖性改变，血药浓度—时间曲线下面积和剂量均呈线性关系，药物峰浓度与给药剂量基本呈正相关，提示rMBP- NAP药物消除符合线性动力学特征，在大鼠的体内过程呈一级消除动力学。予以大鼠5 mg·kg-1rMBP- NAP静脉注射后显示，在肾脏中分布最高，其次为肝脏和肺，在脑组织中浓度最低。该结果也基本反映了rMBP- NAP主要分布到肾脏并由尿排泄的消除途径。

表4大鼠静脉注射rMBP- NAP后的药代动力学参数

rMBP-NAP剂量药代动力学参数药-时曲线下面积/μg·h-1·L-1峰浓度/μg·L-1达峰时间/h半衰期/h2.5mg·kg-1252526.74±18956.979103803.67±3121.2950.251.983±0.4115mg·kg-1625904.66±70638.334229033.333±15100.9490.251.747±0.53610mg·kg-11444486.86±205120.287393333.333±22240.0240.252.006±0.31rMBP-NAP剂量药代动力学参数平均驻留时间/h血浆清除率/L·h-1·g-1表观分布容积/L·kg-12.5mg·kg-12.225±0.20.01±0.0010.015±0.0045mg·kg-12.653±0.3140.008±0.0010.02±0.00610mg·kg-12.979±0.3430.007±0.0010.02±0.004

图3静脉注射rMBP- NAP后的组织器官分布

总之，rMBP- NAP的药代动力学研究是新药药理评价的重要内容之一，它在一定程度上揭示了rMBP- NAP在体内的动态过程，为临床合理用药提供了部分理论依据。

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doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.017

[中图分类号]R969.1

[文献标识码]A

[文章编号]1671- 6264(2016)02- 0222- 04

[通信作者]王建国ranranpeptide@163.com

[作者简介]崔明辰(1964-)，男，河南南阳人，副主任医师，医学硕士。E- mail:ajiao278747551@126.com

[基金项目]漯河医学高等专科学校科研基金(2014- S- LMC10)

[收稿日期]2015- 10- 14[修回日期] 2015- 12- 22

[引文格式] 崔明辰，陈娇，时冉冉，等.双抗体夹心ELISA法研究rMBP- NAP在大鼠体内的药代动力学[J].东南大学学报:医学版，2016，35(2):222- 225.

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