核酸实时荧光PCR法检测高危HPV(16和18型分型)联合TCT检查应用于宫颈癌筛查的价值分析※
2016-04-18李海萍高博文
李海萍，高博文
(1.青海大学附属医院肿瘤妇科；2.武警后勤学院)
核酸实时荧光PCR法检测高危HPV(16和18型分型)联合TCT检查应用于宫颈癌筛查的价值分析※
李海萍1，高博文2
(1.青海大学附属医院肿瘤妇科；2.武警后勤学院)
目的 分析核酸实时荧光聚合酶链式反应方法检测高危HPV(16和18型分型)(PCR12+2)联合TCT检查应用于宫颈癌临床筛查中的价值。方法 将进行宫颈癌筛查的480例受检对象行宫颈脱落细胞的薄层液基细胞学(TCT)、核酸实时荧光PCR检测的同时，对HPV16和HPV18进行分型检测(PCR12+2)、阴道镜活检及组织病理学检查。对检测结果分组(TCT组、PCR12+2组、TCT联合PCR12+2)评价、分析。结果 三组患者病理学检查≥宫颈上皮内瘤变Ⅱ级(CIN II)比较，差异无统计学意义(χ2=3．35，P>0.05)；TCT组阳性率为59.09%，PCR组为64.0%，联合组检测阳性率为94.44%，联合检测的阳性率明显高于单独对HPV16和HPV18进行分型检测的结果，差异具有显著性(P<0.05)。结论 联合核酸实时荧光PCR方法检测高危HPV(16和18型分型)(PCR12+2)与TCT联合检查应用于宫颈癌临床筛查的阳性诊断率高，具有更好的准确性。
核酸实时荧光聚合酶链式反应法 HPV 液基薄层细胞学检查 宫颈癌
美国已将宫颈细胞HPV检测作为宫颈细胞学检查的辅助手段用于宫颈癌初级筛查。国际癌症研究中心则认为，可以将HPV检测作为独立的宫颈癌初级筛查的选择之一[1]。有研究显示，有15种HR-HPV感染与宫颈癌的发病密切相关，50%以上的宫颈癌是由HPV16感染导致，10%～15%的宫颈癌是由HPV18导致[2]。当前临床中应用宫颈癌筛查的方法主要有宫颈涂片检查、液基薄层细胞学检查等，对于患者疾病的诊断和治疗具有重要意义。为探讨HPV16和HPV18分型检测在宫颈癌前病变和宫颈癌筛查中的临床价值，本研究通过分组对照研究探讨单独液基薄层细胞学检查、实时荧光PCR同时对HPV16和HPV18进行分型检测(PCR12+2)，以及联合两种检测方式的阳性率，明确核酸实时荧光PCR法检测高危HPV(16和18型分型)联合TCT检查应用于宫颈癌筛查的分析价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
将2013年1月～2015年12月之间来我院进行宫颈癌筛查的480例受检对象作为研究资料，年龄20～55岁，平均(39±12)岁。所有患者均出现程度不一的外阴瘙痒、白带异常、性交出血、间歇性阴道出血等临床症状。对观察对象行TCT检测、PCR12+2检测和阴道镜活检及组织病理学检查。
1.2 伦理和知情同意
所有观察对象均知情同意，项目通过医疗伦理委员会审查。
1.3 方法
所有组患者给予TCT检测，采用美国TriPath公司生产的AutoCyte Prep型自动制片染色机系列制片，由具备细胞学诊断资质的专业病理医师负责细胞学诊断。细胞学诊断标准采用2001年国际癌症协会的The Bethesda system(TBS)系统[3]。具体方法：使用特制塑料毛刷收集受检对象宫颈外部鳞状上皮与柱状上皮交接位置宫颈管的脱落细胞，然后将组织标本放入到振荡器震荡10 min；然后将细胞转移到装有保存液的保存瓶中，在离心机上进行离心处理，随后将上层清液倒掉；使用稀释液对底部收集得到的细胞团进行稀释，达到合适的比例之后再次使用振荡器进行均匀处理。放入到自动制片机进行高速打散处理，随后吸附到膜管中，最终印制在玻片上，得到直径为2 cm、细胞数在2万个左右的玻片；等待涂片自然干之后使用浓度为95%的酒精进行固定处理，时间为15 min，随后选择应用巴氏法进行染色。
所有组患者给予核酸实时荧光PCR检测，采用广东凯普生物有限公司生产的HR—HPV核酸检测试剂盒检测HR、HPV，同时对HPV16和HPV18进行分型检测，可在同一反应管中通过仪器的4种荧光检测通道分别检测：(1)不分型12种HR．HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)；(2)HPV16；(3)HPV18。
所有患者行阴道镜活检及组织病理学检查。在阴道镜下对醋酸上皮和碘试验不着色区进行多点活检，正常转化区则取3、6、9、12点活检。
1.4 患者的观察指标
对所有患者行不典型鳞状细胞(ASCUS)、高度病变鳞状上皮细胞(HSIL)、低度病变鳞状上皮细胞(LSIL)以及组织学检查，根据TBS分类法对结果进行评价。检查结果为ASCUS、HSIL或者LSIL、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、CA时认定为阳性。
1.5 统计学方法
本研究中的相关数据均录入到SPSS18.0软件实施数据处理，三组患者的检测结果采用百分比(%)的形式表现，以组织病理学检查结果作为金标准，计算三组筛查宫颈癌及癌前病变的敏感度、特异度及阳性预测值和阴性预测值。组间比较采用确切概率法，检验比较采用卡方检验。以P<0.05代表差异结果具有统计学意义。
2 结果
2.1 TCT与组织病理学检查结果的关系
480份标本经TCT检测，阳性结果经阴道镜和宫颈组织病理学检查，以病变程度≥CINⅡ为阳性，病变程度
表1 TCT检测与组织病理学检查结果的关系表 例(%)
CIN：宫颈上皮内瘤变；CA：宫颈癌.
表2 TCT检测与组织病理学检测方法的比较结果
TCT检测阴性患者中有12例宫颈癌症患者，373例非癌患者；在TCT阳性患者中有31例宫颈癌症患者，64例非癌患者，经卡方检验，χ2为81.38，P为0.00，可见TCT检测与病理学检测结果有统计学差异。经过组织病理学检测证实，TCT检测的敏感性为72.1%，特异性为85.4%，阳性预测值为32.6%，阴性预测值为96.9%。见表2。
2.2 PCR12+2与组织病理学检查结果的关系
480例经过PCR12+2法检测，在43例确诊为≥CINⅡ者中，确定HPV16阳性共19例，阳性率为44.2%；确定HPV18阳性有8例，阳性率为18.6%；确定其他HR-HPV阳性共6例，阳性率为14.0%；HR-HPV阴性患者共10例，阳性率为23.3%。见表3。
表3 PCR12+2检测与组织病理学检查结果关系表例(%)
a：有2例为HPV16、HPV18阳性者，经过病理证实为炎症，此例分别计人HPV16(+)、HPV18(+).
PCR检测的阳性患者中宫颈癌患者33例，阴性患者中有癌患者10例，经卡方检验得知，χ2为60.97，P为0.00，可以认为PCR检测结果与病理学检查有统计学差异。经过组织病理学检测证实，PCR12+2作为诊断宫颈癌及其癌前病变筛查的的敏感性为76.7%，特异性为78.4%，阳性预测值为25.8%，阴性预测值为97.2%。见表4。
表4 PCR12+2检测与组织病理学检测方法的比较表
2.3 TCT联合PCR12+2检测与组织病理学检查结果的关系
在病理学检查确诊的43例患者中，联合检测方法确诊出40人，437例非宫颈癌患者中联合检测显示阴性的人群有334例，经过卡方检验，χ2为90.28，P为0.00，可以认为联合检测与病理学检查的检测结果有统计学差异。联合检测的敏感性为93.0%，特异性为76.9%；阳性预测值为28.0%，阴性预测值为99.1%，可见该筛选方法用于区别是否患有宫颈癌的效率比较高。见表5。
表5 TCT联合PCR12+2检测与组织病理学检查的关系表
2.4 三种筛选方法的比较
经病理学检测确诊的43例宫颈癌患者中，经TCT检测出阳性病例31例，12例假阴性；经PCR12+2检测出阳性病例33例，10例假阴性；经TCT联合PCR12+2检测，确诊出阳性病例40人，3例假阴性，三组筛选方案经卡方检验可知，χ2为6.65，P为0.04，小于0.05，可见三种检测方案检测能力有统计学差异。联合检测方案检出正确率要比单独的高，显示联合检测方案的检验准确性更好。
3 讨论
我国宫颈癌的发病率和死亡率均居于世界前列，占据全世界的三分之一[4]。研究发现，宫颈癌会从早期宫颈CIN不断演变，随着时间的发展早期CIN逐渐演变为早期浸润癌，随后发展为浸润癌。大量的研究结果显示，早期宫颈原位癌的5年生存期超过100%，早期癌生存率在90%以上，而宫颈浸润性癌只有67%[5，6]。
根据美国阴道镜和宫颈病理协会(American Society forColposcopy and Cervical Pathology，ASCCP)发布的指南建议：年龄≥30岁的妇女，如果宫颈细胞学检查阴性，但HR、HPV阳性可以选择在12个月后复检HPV和宫颈细胞，或者直接进行HPV16和HPV18的分型检测，如果检测结果阳性应立即进行阴道镜检查，而那些HPV16和(或)18阴性，但其他型别HR-HPV阳性者，应该在12个月后重复进行细胞学检查和HR-HPV检测，叶波等对1374例宫颈鳞癌患者的HPV检测中发现，HPV16和HPV18可以在74.3%的宫颈癌病例中被检测到[7]。此外，HPV18还引起了超过35%的宫颈腺癌的发生，而宫颈腺癌通过现有的细胞学筛查手段是很难发现的。
本研究结果与其他研究结果存在定量差异，许剑利[8]等回顾性分析了184例患者行高危型HPV检测及TCT检查，比较两种检测方法在宫颈癌筛查中阳性和阴性预测值，结果显示184例患者中63例病理检查结果为阳性，阳性预测值分别为34.23%、50.00%，阴性预测值分别为0、67.06%，二者应联合应用于宫颈癌的筛查具有更高的准确性。臧元怡[9]等对2140例门诊宫颈标本同时行HR-HPV检测和TCT检查，结果显示HR-HPV DNA检测与TCT联合检测灵敏度(95.64%)、阳性预测值(43.07%)及阴性预测值(98.75%)与单独检查比较均有不同程度的提高(P<0.05)。本研究结果与其他研究结果存在定量差异，分析原因，考虑与样本数量不同；TCT取材位置不当(未包括整个宫颈液基表面，特別是绝经后妇女，鳞柱交界退缩至颈管内，刮片时不易刮到)；染色液未及时更换，核染色过浅，看不清染色质结构；光源不稳定导致光线太弱看不清核的结构，光线太强，核内染色质变浅，易把恶性误认为良性[10]；HPV检测结果受实验温度、pH等因素有关。
本研究发现，TCT联合HR-HPV检测在宫颈癌筛查中均具有良好的敏感性、特异性和准确性：TCT与HR-HPV的PCR检测均采用专门的采样器采集子宫颈细胞样本，并将样本置入装有细胞保存液的小瓶中进行漂洗，可有效确保获取足量、有效的宫颈脱落细胞样本，同时前者通过对样本进行分散和过滤后，可有效清除宫颈黏液和炎性细胞，减少对检测的干扰；而后者则可能通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪和实时在线监控反应过程，利用其高通量特性对HR-HPV基因亚型进行同步检测和筛查，从而准确检测HR-HPV及其分型，且二者相比于传统病理学检测，可有效减少样本采集操作对患者的创伤，且操作也较为简单和快速，更适合于大范围人群的筛查。故TCT联合HR-HPV的PCR检测适合作为临床宫颈癌筛查方法[11]。
此外，本研究通过对不同方法筛查宫颈癌的效能进行对比，发现TCT联合HR-HPV检测的敏感度、准确度明显高于单独TCT检测，前者漏诊率明显低于后者，但两种检测方法在宫颈癌筛查中的特异度和误诊率基本相同。这可能是由于HR-HPV感染后人体后，引起机体宫颈黏膜的鳞状上皮增殖而出现上皮细胞受损症状，显著增加诱发宫颈病变的风险，检测是否感染虽可协助医师进一步筛查宫颈癌，但并非所有HR-HPV患者会伴随出现宫颈病变症状，且在HR-HPV感染并引起宫颈病变的过程中，可能需要一定的时间，同时出现宫颈病变后并非所有HR-HPV患者会发生发展为癌变，故其对宫颈癌变并无特异性，这也提示当患者持续出现HR-HPV感染症状 ，其出现宫颈病变及癌变的风险会呈持续不断增加的趋势，因此可将HR-HPV的PCR检测作为宫颈癌筛查中必要的手段之一，并不断扩大筛查范围，除有效提高宫颈癌筛查的敏感性和准确性外，还可指导对检测结果阳性者进行早期的干预治疗，进而降低宫颈癌发生发展的风险，提高高危人群的治疗疗效。
综上所述，TCT联合HR-HPV的PCR检测在宫颈癌筛查中具有更为良好的敏感性和准确性，有利于避免漏诊的发生，且具有操作简单、快捷、低创等优点，值得临床作进一步推广。
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Nucleic acid real-time fluorescence PCR detecting high risk HPV(type 16 and 18)combined with TCT to screen cervical cancer
LI Hai-ping1，GAO Bo-wen2
(Department of Gynecological Oncology，Qinghai University Affiliated Hospital；2.Logistics University of PAP)
Objective To analyze the value of nucleic acid real-time polymerase chain reaction method on detection of high risk HPV(16 and 18 type)(PCR12+2) combined with TCT to screen cervical cancer.Methods 480 cases of cervical cancer screening were examined as follows：Thin - layer liquid-based cytology(TCT)of cervical exfoliative cells and real-time PCR detection of nucleic acid，andclassification detection(PCR12+2)，colposcopic biopsy and histopathological examination of HPV6 and HPV18.Results There was no significant difference in pathological examination of cervical intraepithelial neoplasia(CIN II)among the three groups(χ2=3．35，P>0.05).The positive rate of each group were as follows：TCT group 59.09%，PCR group 64.0%，combined group 94.44%，respectively.The positive rate of combined detection was significantly higher than those of HPV16 and HPV18 which were carried out respectively，and the difference was significant(P<0.05).Conclusion The real-time PCR assay for detection of high-risk HPV(type 16 and 18)(PCR12+2)combined with TCT for cervical cancer screening show higher positive rate and better accuracy for diagnosis.
Nucleic acid RT-PCR HPV Thinprep Cytology Test Cervical cancer
※：青海省医药卫生科技项目课题2015年指导性科研课题 李海萍(1972～)女，满族，青海籍，副教授
R323
A
10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.010
2016-03-03
