钙离子选择电极的发展现状及应用

李新贵，蔚文慧，黄美荣*

(1污染控制与资源化研究国家重点实验室，同济大学环境科学与工程学院，上海200092)

(2先进土木工程材料教育部重点实验室，同济大学材料科学与工程学院，上海200092)

钙离子选择电极的发展现状及应用

李新贵1，蔚文慧2，黄美荣1*

(1污染控制与资源化研究国家重点实验室，同济大学环境科学与工程学院，上海200092)

(2先进土木工程材料教育部重点实验室，同济大学材料科学与工程学院，上海200092)

基于国内外最新研究文献和自身研究工作，系统总结了商品钙离子选择电极以及新研发的高性能钙离子选择电极的性能特点，重点阐述了以导电聚合物为基膜构建的高性能固接钙离子选择电极的设计与构建。导电聚合物所特有的富电子共轭结构以及电子导电和离子导电的双重导电功能，使其用作钙离子选择传感膜的基膜表现突出，特别是其掺杂剂大分子有机磷酸既可以实现导电聚合物共轭导通，又可以对钙离子产生静电作用而发挥离子载体功能。目前研究的钙离子选择电极可以实现微摩尔浓度水平的钙离子检测，在医疗诊断、药物检测、食品营养与安全等等诸多方面将发挥越来越多的作用。

钙离子；离子选择电极;离子载体;导电聚合物；应用

0 引言

作为地壳中含量第五的元素，钙是整个生态系统得以正常运行的重要组成。首先，钙广泛存在于海水、土壤水及自来水等水源中，对于海洋及地面上动植物的生存有着深远的影响[1-2]。钙镁离子作为水质即水硬度的组成离子，测定自来水中钙离子的含量对于判断水质至关重要。其次，对于人体来说，钙作为人体中含量最多的无机盐，不仅是构成骨骼和牙齿的主要矿物质成分，而且在机体的各种生理和生化过程中起着重要作用。钙可以维持人体循环、呼吸、神经、内分泌、消化、血液、肌肉、骨骼、泌尿、免疫等各系统正常生理功能，维持人体细胞的正常状态。人体中钙元素主要来源于牛奶、肉类及蔬菜等食物。因此测定人体中血钙、尿钙、胆汁钙及唾液钙甚至牛奶等食物中钙的含量在维持人体正常的生理机能及对各项生理机能的监控方面有着显著的影响[3]。

对钙离子含量的一般检测方法有等离子色谱法、火焰原子吸收分光光度法及常规滴定法。对常规的滴定法而言，测试步骤复杂；而对等离子色谱法和火焰原子吸收分光光度法而言，对样品的要求较高，需要预先处理样品，且实验仪器昂贵测试过程复杂，需要专业的技术人员操作。而以钙离子敏感膜为响应基础的钙离子传感器能够有效地回避这些问题。其所具有的操作简单，便携式、响应快速、成本低廉、对样品无污染且可微型化等特点为新型钙离子传感器的应用开拓了方向。基于钙离子敏感膜的钙离子传感器包括电位型、电流型及电导型等。

钙离子选择场效应晶体管(ISFET)是基于电流型传感机理的新型钙离子传感器。它是将钙离子选择电极通过一定的集成技术与场效应管组装而制备的新型钙传感器。该传感器基于电流传感，能够获得稳定且放大的离子信号强度，且无过膜离子流的存在，一定程度能够降低检测下限，且需要样品的体积较少，输出信号无阻抗，响应速度更快[4]。以聚氨酯为传感膜的钙离子选择场效应晶体管显示出了宽至5×10-6~2×10-2mol/L的线性响应范围，长达9~10个月的使用寿命，在检测土壤排水中钙含量上与常规滴定法相比相差不大[5]。此外，在牛奶血清中钙含量的测试上，标准偏差也仅为3%~7%[6]。除了钙离子选择场效应管外，同样基于电流响应机理的钙离子选择电导微传感器也表现出了一定的优势[7]。由于其摒弃了外参比电极的使用，为钙离子传感器的微型化提供了便利。但无论是钙离子选择场效应管还是钙离子电导传感器，均需考虑到钙离子选择电极与其他元器件的集成步骤，这增加了传感器的设计难度。

另一种电位型传感器离子选择性电极(ISE)是依据离子选择膜(ISM)电位随溶液中离子浓度变化而建立的电化学传感器。ISE的发展史远远长于ISFET，100多年前就发明了第一杆ISE玻璃膜电极。现在与之并驾齐驱的还有1966年发明的以氟化镧单晶为传感元件的氟离子选择电极[8]。这两种电极在当今已获应用的离子选择性电极中最为经典的，它们在包括环境水质分析监测在内的各个领域发挥着不可替代的作用。目前，基于不同的离子载体，ISE已经能够检测多种物质如牛磺酸[9]及银[10]、铜[11]、铅[12]和汞[13]等重金属离子。ISE具有比ISFET更简易的制备工艺，无需封装即成电极，且坚固耐用。综合考虑制作成本、操作难易、使用寿命等因素，加上其可携带性，ISE将是大量常规样品分析的最佳选择之一。该文主要就钙离子选择电极的性能优化，特别是近年报道的钙离子选择电极中导电聚合物基膜的研究进行总结，旨在促进钙电极的进一步蓬勃发展，使其在各种环境水质分析、医疗诊断等领域发挥越来越大的作用。

1 现有国内外商品Ca2+-ISE

钙离子选择电极(Ca2+-ISE)自研发出来之后就得到了广泛的研究与应用。现今商品化的钙离子选择电极均以增塑PVC为基膜材料。表1总结了国内外商品钙离子选择电极的电位响应性能。可以发现，对商品化的钙离子选择电极来讲，其使用的钙载体仍然为最早研发磷酸盐类。电极的检测线性范围多为10-5～10-1mol/L，检测下限在10-6mol/L，能够满足绝大多数环境中钙含量的检测。

国内最早商品化并得到广泛应用的商品钙电极为402型钙电极，而到目前为止国内常见的商品钙电极主要型号为PCa-1、PCa-1-01及PCa-27。国外最早的商品钙电极为美国Orion公司生产的92-20及93-20型电极。这些商品钙电极在血钙、尿钙、植酸中钙以及珍珠液中钙的测定上均表现出了良好的实际应用性和准确率。但需要指出的是，以增塑PVC及磷酸盐类钙载体为电活性物质的商品钙电极存在选择性不高及使用寿命不长等问题，因而仍旧存在广阔的研究空间。

2 钙离子选择电极性能优化策略

与重金属离子选择电极需不断拓展检测下限来实现痕量测量[23]有很大的不同，Ca2+-ISE的优化提升主要不在检测下限的优化，而是着重在选择性、响应稳定性及使用寿命等性能的提升。这可以从以下几个方面入手。首先，设计与合成出高选择性、高敏感性的新型钙载体；其次，选择适宜的钙传感基膜；最后，优化电极组装与结构，包括各种调制激活等手段，使得电极性能进一步提高。更为重要的是，随着生物技术的发展，生物体内如细胞内钙含量的原位测定[24-26]也引起了研究者们的关注与重视，这推动了钙离子选择电极的微型化。同时钙离子选择电极在临床血钙尿钙的常规测试中也越来越频繁，针对长寿命、耐用性钙离子选择电极的设计与研究也是满足医疗诊断领域所寻求的目标钙电极。

表1 现有国内外商品Ca2+-ISE的电位响应性能Tab.1 Potentiometric response performance of commercially available Ca2+-ISE

3 基于新研发载体的Ca2+-ISE的性能

自1967年Ross博士研制的钙离子选择电极中最先使用了二正癸基磷酸钙[27-28]作为钙离子载体后，磷酸盐类钙载体对钙电极性能的优化与提升首先受到了关注。磷酸盐头部带有一价负电的磷酸根基团与钙离子进行静电络合作用，从而实现钙离子的传感响应，其分子结构见图1(a)。以二癸基磷酸钙为钙载体、基于增塑PVC膜的内充液液接式钙离子选择电极[29-30]具有宽约为10-5～10-1mol/L的线性响应范围，低至10-6mol/L的检测下限。以分别溶液法测定的Na+、K+、Ba2+、Mg2+及Al3+的选择系数的对数不大于-1.01，这为其测定土壤及水样中钙含量提供了基础[30]。与原子吸收光谱法测定相比，该钙电极测定的土壤及水质样品钙含量的相对偏差分别为 3.5%和 4.6%，表现出了较高的准确度。

图1 典型钙载体结构(a)二癸基磷酸盐；(b)硫代乙酰胺Fig.1 Chemical structure of calcium ionohores(a)DDP-;(b)TAA

但是，这种有机磷酸盐类钙载体合成相对来说较为复杂。通过氢键、静电作用等超分子作用力将客体有机小分子硫代乙酰胺(TAA)吸附于主体凹凸棒石 (ATT)表面形成主客体结构TAA/ ATT，以该主客体复合物质作为钙载体为新型钙载体的研究提供了思路[31]。硫代乙酰胺的分子结构见图1(b)。其上带正电荷的氨基与凹凸棒石上氢氧基团上带负电荷的氧原子相互作用，使其被吸附在凹凸棒石表面形成类似半环状的穴形结构。通过该穴形结构及硫代乙酰胺分子中的碳硫基团来实现对钙离子的选择响应。值得一提的是，该主客体结构形成的穴状结构更进一步的强化了对钙离子的响应，与以二癸基磷酸钙为载体的钙电极相比，该钙电极对Na+、K+等一价离子的选择性明显提高，其选择系数的对数低至-3.51。此外，需要指出的是，不论是以二癸基磷酸钙或是硫代乙酰胺/凹凸棒石复合物为钙载体的钙电极，其响应斜率均为20 mV/pCa以下，较偏离理论能斯特响应值29.6 mV/pCa，这可能是钙载体本身及阴离子排除剂未添加所致。而尽管也没有添加阴离子排除剂，以土霉素合钙为钙载体、聚苯胺为中间传导层的铂基固体接触钙电极[32]却实现了近能斯特响应，其响应斜率高达28.5 mV/ pCa，这与土霉素对钙离子高的选择性密切相关，其与钙离子生成的配合物累积稳定常数的对数值高达24.625。

除了基于增塑PVC而研发的钙载体外，一些基于非增塑基膜的钙载体也表现出了良好的电极性能，见表2。如以羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)为钙离子活性物质，醋酸纤维素膜为基膜的内充液式液接钙电极[33]不仅表现出了近能斯特响应，其适用pH范围更宽至2～9。且由于没有增塑剂的添加，活性组分随着增塑剂的泄漏大大减少，其使用寿命长至3个月。羟基磷灰石及醋酸纤维素膜的生物相容性使得其在生物领域的应用具有前景。而以聚合-环糊精包结2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基苯酚(5-Br-PADAP)为钙载体，将其与石墨粉与石蜡混合后所制备的碳糊钙电极[34]对Cu2+、Mg2+及Cr3+显示出了超高的选择性，其选择系数的对数分别为-14.05，-15.4及-14.7。此外，对于这两种无增塑剂添加的钙电极来说，阴离子排除剂也均未加入，这可能是检测下限稍高的原因[34]，而羟基磷灰石中的磷酸基团可能部分起到了阴离子排除剂的作用使得线性范围及检测下限没有受到明显影响[33]。另外，由表2中发现，基于新研发载体的钙电极其适用pH范围多处于中性略偏碱性。

表2 基于增塑PVC膜和非增塑聚合物膜的Ca2+-ISE的电位响应性能Tab.2 Potentiometric response parameters of Ca2+-ISE developed based on plasticized PVC and polymer membrane matrix without plasticizer

4 基于导电聚合物基膜的Ca2+-ISE

在针对离子选择电极的基膜的改进研究中，能够取代PVC基膜材料中使用最多的是无增塑聚丙烯酸酯及其共聚物[35-37],而且，同时可以将离子载体以及离子交换剂分别或同时通过酰胺键或酯键共价接入大分子链上，在改进活性物质的流失方面显示出来明显的改进作用。然而，这种非增塑的聚丙烯酸共聚物电化学性能远不及增塑PVC，使其电位读数的稳定性变差。如何提升这类聚合物基体的电导性就成为发展这类基体材料的新瓶颈。尽管降低其膜电阻，提升电位稳定性可以采取在基体分子链上引入导电性共轭聚合物链段[38]，但这样一种基膜材料的改性需要考虑的不仅是选择什么样的导电聚合物去接枝，还需要考虑选择怎样的接枝链段去实现接枝。而导电聚合物本身具有的优异离子和电子的电信号转换和传导功能，使其广泛应用于电化学传感器领域，不仅成功地作为离子载体应用于超敏耐用的ISE中[39-42],而且用作SC-ISE的离子-电子传导转换中间层，像聚3-辛基噻吩(POT)[43-44]，聚3,4-乙撑二氧噻吩(PEDOT)[45]，聚苯胺(PANI)[46-47]，聚吡咯(PPy)[48]等作为离子-电子转换层可以显著避免水凝胶和离子导电玻璃的不足，从而获得较高稳定性SC-ISE。特别是疏水性导电聚合物中间层还可以有效避免中间水层的产生，进一步提高电极电位的稳定性。

利用导电聚合物自身所具备的离子-电子传导特性[49]，以导电聚合物直接作为钙离子选择基膜材料则不仅可以回避基膜化学改性的难题，还可以直接利用其本身所具有的离子-电子双重导电特性，这为解决非增塑基膜的导电性找到了方案。实际上，早在1999年就有导电聚合物POT作为K+-ISE基膜的报道[50]。这方面研究的技术难点在于绝大多数导电聚合物是难溶性的，会阻碍其加工成膜而难以制成电极。幸运的是，化学氧化聚合法制备的导电聚合物在经过大分子有机酸掺杂后，其在四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)等常见有机溶剂中的溶解性可以大大增加并转变为半导态甚至导电态。

目前应用于钙离子选择电极基膜材料的导电聚合物主要为聚苯胺(PANI)、聚吡咯(PPy)及聚吲哚(PIn)，详见表3。对于化学方法合成获得的粉末状导电聚合物PANI，必须将其进行溶解或均匀分散后才能进行成膜加工。而导电聚合物又必须经过掺杂后才能获得导电性。在钙离子选择基膜中，巧妙地选用大分子有机磷酸作为掺杂剂，而这些有机磷酸盐本身又与钙离子会产生静电相互作用，在早期的钙离子选择电极的研究中经常被用作钙离子的载体[51-54]。选用这样的有机酸，即可解决PANI的掺杂赋予其导电性，又可以使得掺杂在其中的有机酸发挥钙离子载体的作用，足见这一研究策略的高明性。将二(2-乙基己基)磷酸(H+DEHP-)[55-56]及二-(四-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基磷酸(DTMBP-PO4H)[57]掺杂的PANI作为基膜材料所构建的固接钙离子选择电极凭借PANI的离子-电子导电特性，表现出了较好的钙离子响应性，特别是大大提高了电极的响应电位稳定性。所专门加入的ETH1001钙离子载体可以额外补充对钙离子的络合能力，从而进一步提升了电极性能。由于这种专门的钙离子载体本身为液态油状，对基膜中离子交换剂KB(ClPh)4也起到了一定的分散作用。w=30%ETH1001及w=30%KB(ClPh)4的加入成功的将膜电阻由125 KΩ降至2 KΩ，大大提高了膜内离子的流动性。此外，ETH1001与钙离子形成离子络合物可以充当聚苯胺氧化还原过程中的电荷补偿离子对，抑制了PANI的氧化还原敏感性，这在导电聚合物在离子选择电极的应用上是大有裨益的。

表3 基于导电聚合物基膜的Ca2+-ISE的电位响应性能Tab.3 Potentiometric response parameters of Ca2+-ISE developed based on conducting polymer as membrane matrix

考虑到HDEHP本身就可作为钙载体，简单将离子交换剂四辛基氯化铵 (TOACl)与掺杂HDEHP的PANI溶于THF中，滴铸于玻碳电极上构建的固接钙电极可以达到相近的电极性能[56]。但是由于TOACl本身的溶解性的限制，尽管膜电阻降低了三个数量级，其对电极性能没有明显的提升，且Mg2+对钙离子的干扰严重。因此，考虑到对电极性能的进一步提升，回避额外载体的加入，选择加入增塑剂来促进阴离子排除剂在PANI膜中的分散[57]。二-(四-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基磷酸(DTMBP-PO4H)掺杂的PANI与增塑剂苯基磷酸二辛酯(DOPP)及离子交换剂三十二烷基甲基氯化铵(TDMACl)或者KTpClPB混合溶解于二氯甲烷(DCM)中浇铸法所制备的固接钙离子选择电极明显的探测下限明显降低至 10-7mol/L，且对Na+、K+、Li+及Mg2+等离子选择性也明显提高，选择系数的对数不大于-3.5。

直接在基体电极上进行电化学沉积可以回避导电聚合物的难加工成膜性，这一方法对于比PANI还要难以溶液加工或熔融加工的PPy显得更为有意义。比如，在酸性饱和钙素色溶液中，利用电化学循环伏安法在铂电极上可以沉积出平整光亮的掺杂钙色素的聚吡咯膜[61]，该膜也可成为钙离子选择电极基膜[58-59]。其中，钙色素用作钙离子配体以保证钙离子选择电极的响应性能。通过电化学循环伏安法合成的等摩尔掺杂有樟脑磺酸的聚吲哚膜[62]沉积在直径为2 mm的铂盘电极上，用于钙离子选择电极表现出了较好的电极性能。仅仅依靠樟脑磺酸上的磺酸基团作为钙离子配体 (图2)，就可以使其检测下限达到10-5mol/L[60]。不过，目前水平的电极响应斜率还略微偏低 (表3)，这与其无额外的钙离子载体有关。然而，该项研究对钙离子选择电极的设计理念为导电聚合物在离子传感电极上的应用提供了全新的思路。

图2 铂盘电极上等摩尔掺杂有樟脑磺酸的聚吲哚膜与钙离子的相互作用[60]Fig.2 Interaction between Ca2+and PIn film doped with equal molar CSA on Pt disc[60]

5 钙离子选择电极性能的应用

钙离子选择电极(Ca2+-ISE)是离子选择性电极中的优秀电极之一。在20世纪60年代由Ross博士首先研制出来之后，就在美国被冠以Orion商标问世，至此在临床诊断、食品检测和水质检测等领域发挥了重要作用。血液、尿液、唾液以及胆汁中游离的离子钙的含量对生物体的生命健康有着重要的预警作用，而钙电极在测定其中离子钙的含量上表现出了快速、精确、简单及成本低廉等优异特点。因此自问世以来，钙电极在临床诊断中已经有广泛的应用。早在1970年，美Orion 92-20以及98-20型钙电极装置[63]就用于样品血清中浓度范围为0.94～1.33 mmol/L的离子钙的直接检测，并且在pH等条件确定的情况下，其在几个月内的偏差仅为6%。而用国产钙电极[64]测定的医院内189名正常人体血清中钙含量时，也表现出了较好的重复性以及准确性，其变异系数＜2%，回收率为95.6%。在尿钙的测定中，国产402型钙电极[65]的回收率在（100±7）%以内，且变异系数均为5%，准确度较高。此外，利用钙离子中性载体(ETH1001)制成微电极[66－67]对唾液中生理性游离钙的浓度做测试和分析，从而为研究钙在龋齿病形成过程中的生理影响提供了方向。再如，利用国产钙离子选择电极[68]对21例色素结石患者T管胆汁进行钙离子浓度测定，其测定的钙离子浓度1.7×10－4～1.0×10－3mol/L与国外同时期报道[69]中胆汁的超滤钙接近，准确性好，从而有利用研究钙在胆结石形成中的作用。

在水质监测和食品检测领域，美Orion 97－20 ion plus型商品钙电极[20]和国产402型钙电极[14]实现了对模拟牛乳超滤液和牛奶以及豆奶中钙的测试，特别是豆奶的测定，pH5～pH7时仅依靠加入植酸酶来辅助被植酸所绑定钙的释放，为其它含植酸丰富的谷物和豆类饮料食品等营养食物全钙的测定给出了有益启示。而新研制的非商品电极，含ETH129钙载体的增塑PVC膜基液接钙电极原位测定海藻均质424培养基中钙离子浓度与AAS所测钙浓度能够高度吻合，表现出了较高的准确度[70]。与液接电极相比，另一种安置于浮标上水密封系统的固接全固态微型电极原位测量海水中钙含量，显示出了较好的应用潜力[71]。再者，一种新型的电位型传感器阵列能够同时且直接的测定西红柿和黄瓜水营养液中的Ca2+、NO3－和K+的浓度，这在监控植物生长及实时调整营养液配比有着很好的应用[72]。值得一提的是，以对Cl－、Na+/K+、Ca2+/Mg2+、NO3－响应的纸基电极构建的电子舌能够简单方便地识别瓶装矿泉水是否造假，相较于其他电化学传感技术，该方法更为简单，且能够选用类似于智能手机的设备作为数据读取器，大大简化了测定流程[73]。

6 结束语

传统的电位型传感器都是基于PVC基体传感膜的，其选择性依靠其中的活性组份如离子载体或敏感性分子受体与目标物的相互作用，而由于PVC是一种2倍增塑剂增塑的聚合基体，增塑剂的固有迁移流失缺憾会导致膜中活性组分的加快流失，从而大大缩短电极的使用寿命。近年来研究报道的非PVC聚合物基膜，有望改变这一不利因素获得高传感检测响应性能，特别是使用寿命。相比较于常用的交联聚丙烯酸共聚物基体，导电聚合物以前独特的成膜能力、电子导通和离子导通功能以及与钙离子的静电相互作用使其在钙离子选择电极研究中崭露头角，为新型基体材料拓宽了新思路，而目前用于此目的的导电聚合物为数不多，今后不断尝试其它导电聚合物显得很有必要，这一研究思路值得进一步探究。

较等离子色谱法、火焰原子吸收分光光度法及常规滴定法这些钙离子检测方法而言，钙离子选择电极法操作方便，响应性能良好，灵敏准确，对样品前处理过程简单，因而成为了目前钙离子检测的主要方法，在临床诊断、食品检测和水质检测等领域得到了广泛的应用。基于新型钙离子载体、无增塑基膜材料及创新电极组装方式，研制出具有高选择性、长寿命、长期稳定性特点的钙离子选择电极是目前研究的重要方向。近些年来，通过选择具有优异导电性能的高分子聚合物同时作为钙载体和基膜材料[60]为提升电极稳定性、延长电极使用寿命提供了新的研究方向。而以高选择性双层磷脂为钙载体及基膜所构建的纳米氧化锌基微型化钙电极[26]更是为其在生物领域，特别是细胞内钙离子的原位连续检测创造了条件。可以说，钙离子选择电极的研究还刚刚起步，让我们期待高选择性高灵敏性的新一代钙离子选择电极早日出现。

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Progress and applications of calcium ion-selective electrode

Li Xin-gui1,Yu Wen-hui2,Huang Mei-rong1*
(1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resources,Tongji University，Shanghai 200092,China)
（2.Key Laboratory of Advanced Civil Engineering Materials of the Ministry of Education,College of Materials Science and Engineering,Tongji University,Shanghai 200092,China）

Based on the latest literatures and our previous research,the performance and characteristics of both commercial and newly developed calcium ion-selective electrode (Ca2+-ISE)was systematically summarized.This review specifically focuses on the most recent advances in the design and construction of solid contact Ca2+-ISE with conducting polymers as sensing membranes.Both the electron-rich conjugated structure and the electronic and ionic conductivity of the conducting polymers makes them a prospective membrane matrix for Ca2+-ISE.The macromolecular organic phosphoric acid dopant not only enables the conducting polymer conjugate on the whole molecular chains,but also could be served as a calcium ionophore via electrostatic effects.Nowadays,Ca2+-ISE can detect calcium ions as low as micromolar level and it would become a powerful tool for medical diagnosis,drug testing,food nutrition and safety,and many other aspects.

calcium ion;Ion-selective electrode;ionophone;conducting polymer;application

国家自然科学基金资助项目(No.51273148)，污染控制与资源化研究国家重点实验室自主基金项目(No.PCRRY14003)

*通信联系人,E-mail:huangmeirong@tongji.edu.cn