基于聚乙烯亚胺还原的金纳米颗粒为基底构建的“signal on”型高灵敏ECL传感器铅离子检测

邓 炜，雷燕梅，徐 畅，祁 乐，苟桃吉，高 明*

（1.重庆市三峡库区农业面源污染控制工程技术研究中心，西南大学资源环境学院，重庆400715)

(2.重庆市建设用地事务中心，重庆400015)

(3.重庆市纳米材料及传感技术工程实验室，西南大学化学化工学院，重庆400715)

(4.重庆市烟草专卖局，重庆400023）

基于聚乙烯亚胺还原的金纳米颗粒为基底构建的“signal on”型高灵敏ECL传感器铅离子检测

邓 炜1,2，雷燕梅3，徐 畅4，祁 乐1，苟桃吉1，高 明1*

（1.重庆市三峡库区农业面源污染控制工程技术研究中心，西南大学资源环境学院，重庆400715)

(2.重庆市建设用地事务中心，重庆400015)

(3.重庆市纳米材料及传感技术工程实验室，西南大学化学化工学院，重庆400715)

(4.重庆市烟草专卖局，重庆400023）

该实验结合目标物循环与杂交链式反应（HCR）信号放大策略，构建了用于检测Pb2+的“signal on”型ECL生物传感器。该传感器可以通过Pb2+和脱氧核酶的特异识别作用，循环剪切固载在电极表面的发卡型底物链H0，在实现目标物循环的同时使得电极表面越多的H0被剪切为DNA残链，获得的DNA残链继而作为引物打开发夹探针H1和H2引发HCR反应，形成由H1和H2交替杂交形成的长双链聚合物。这些双链聚合物可以通过静电吸附作用固载大量的邻菲罗啉钌配合物（Ru(phen)32+）。利用固载在电极基底的PEIAu复合纳米材料对发光试剂的共反应作用显著放大检测信号，构建了对Pb2+的“signal on”模式ECL检测新方法。实验结果表明，在Pb2+浓度范围为1×10-12mol/L~1×10-8mol/L之间，表现出良好的线性关系，其检出限为3.33×10-13mol/L。

邻菲罗啉钌配合物；“signal on”；PEI-Au复合纳米材料；共反应试剂

0 引言

通常，生物识别探针（如蛋白，酶，抗体，适体）含有或较容易修饰上氨基或巯基，这使得金纳米颗粒往往可以用来标记生物识别探针[1-3]。以氯金酸（HAuCl4）为前驱体，在还原剂的作用下得到金纳米颗粒。其还原剂不仅可以将AuCl4-还原为Au(0)，同时还能作为稳定剂结合在金纳米颗粒表面。聚乙烯亚胺（PEI）是一种水溶性的高分子聚合物，其单体中含有2个碳原子和1个氮原子，分支状的PEI分子中含有伯胺、仲胺和叔胺，且每个氨基都能质子化[4]，因此PEI既具有还原性同时又是ECL钌配合物的有效共反应试剂[5]。以PEI为还原剂制备金纳米颗粒复合材料（PEI-Au），PEI不仅可以修饰到金纳米颗粒表面通过共价作用来固载适体探针[6]，而且可以作为钌配合物的共反应试剂[7]，增强ECL响应信号。

纳米金刚石作为碳纳米材料的一员，其具有极大的比表面能和较高的比表面积，且其透光优异[8]。但是，纳米金刚石在介质中分散稳定性差，容易发生团聚，使得纳米金刚石的应用必须要解决其在介质中的分散性及稳定性问题。其中，高分子阳离子交换剂Nafion良好的成膜性质和较大的黏度可以使得纳米金刚石均匀的分散到其中，由于其具有良好的稳定性，因此可用于电极表面修饰，且Nafion-纳米金刚石复合膜表面呈负电荷，可以通过静电吸附作用进一步固载PEIAu纳米复合物[9]。基于此，该实验利用目标物循环和杂交链式反应（HCR）信号放大策略，构建用于检测Pb2+的“signal on”型ECL生物传感器。选择邻菲罗啉钌配合物（Ru(phen)32+）为ECL发光试剂，使其嵌入双链DNA聚合物中，再在PEI-Au的共反应作用下，显著放大检测信号，从而实现对Pb2+的灵敏检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

聚乙烯亚胺 (PEI)、Nafion(w=5%)、氯金酸（HAuCl4）和 6-巯基己醇 （MCH）购于美国Sigma-Aldrich公司；纳米金刚石（ND）购于百灵威科技有限公司；邻菲罗啉钌（Ru(phen)32+）购于苏州钠凯科技有限公司；磷酸缓冲溶液（PBS，0.1 mol/L，pH7.4）是由0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L KH2PO4和0.1 mol/L KCl混合配制而成；50 mol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH7.4）用于配制适体溶液；所用其它试剂均为分析纯或优级纯，实验用水均为二次去离子水。DNA单链由大连宝生物合成，对应的序列为：

MPI-A型电致化学发光分析仪（西安瑞迈电子科学技术有限公司，中国）用于ECL检测；利用CHI600E型电化学工作站（上海辰华仪器公司，中国）用于电化学相关表征；检测过程中使用三电极体系，即用修饰了的玻碳电极（GCE,Φ=4 mm）作为工作电极，铂电极作为对电极及Ag/AgCl（饱和KCl）电极作为参比电极。BRANSONIC 200超声清洗仪 （德国BRANSON ULTRASCHALL公司）；MP230酸度计 （瑞士Metter Toledo公司）用于调节pH；SCZL-2数显恒温磁力搅拌器(上海KANG-YI仪器有限公司，中国)用于加热和搅拌；TGL-20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。AB204-S电子天平(瑞士Metter Toledo公司)用于称量。纳米材料的形貌用扫描电子显微镜（SEM,S-4800，日本Hitachi Instrument公司）表征，加速电压为15~20 kV。

1.2 PEI还原的纳米金颗粒（PEI-AuNPs）的制备

用PEI作为还原剂制备金纳米颗粒 （PEIAuNPs）的步骤如下：首先，50 μL PEI（5%）溶于100 mL去离子水中，再加入100 μL HAuCl4溶液（1%），混合搅拌过夜，利用静电吸附作用将AuCl4-吸附在带正电的聚乙烯亚胺树枝上。然后，将混合溶液加热到50℃，可以观察溶液的颜色由淡黄色变为蓝色，说明纳米金颗粒的生成。最后，停止加热，室温下静置冷却，离心洗涤（16000 r/min，20 min），得到带正电荷的PEI-AuNPs。并将得到的沉淀分散在10 mL去离子水中，保存于冰箱备用。

1.3 核酸适配体传感器的制备

核酸适配体传感器的制备过程如图1所示：在修饰电极之前，将GCE（Ф=4 mm）分别用0.3、0.05 μm的Al2O3粉打磨抛光，再分别用乙醇和蒸馏水超声洗涤，室温下晾干备用。然后，将1 mg金刚石粉末超声分散在1 mL Nafion（1%）乙醇溶液中，取10 μL的分散液滴加到预处理好的GCE表面，室温下晾干形成一层Nf-金刚石膜，使电极表面带上负电荷。随后，将制备好的10 μL的PEI-AuNPs胶体溶液滴于电极之上。在室温下孵育4 h以后，通过静电吸附作用将带正电的PEIAuNPs固载于电极表面。接下来，10 μL的H0（2.5 μmol/L）滴于上述修饰电极表面，在37℃下反应孵育12 h，通过形成Au-S键将Pb2+识别的底物链 （H0）固载于电极表面。接下来，15 μL MCH （1 mmol/L）滴于电极表面并在室温下反应40 min，用于封闭非特异性吸附位点。将其置于4℃冰箱中存储，备用。

图1 ECL生物传感器制备过程的原理图和可能的ECL发光机理Fig.1 Illustration of the stepwise ECL biosensor fabrication and the possible mechanism of ECL process

1.4 测试方法

该实验中电致化学发光采用MPI-A型分析仪测试。测试前将制备好的传感器，滴加10 μL Pb2+识别的酶链（LC，2.5 μmol/L）和5 μL不同浓度的Pb2+溶液，室温孵育2.5 h，Pb2+识别的底物链H0被切断，释放酶链进行下一个循环剪切，同时电极表面生成单链的DNA产物。接下来，滴加5 μL H1（2.5 μmol/L）和5 μL H2（2.5 μmol/L）（实验前，在水浴条件下将稀释的H0、H1、H2加热至90℃维持5 min再自然冷却，使得DNA链发卡式结构形成），室温孵育2 h，通过单链DNA产物诱发杂交链式反应放大 （HCR）,生成长的双链DNA分子。然后,10 μL Ru(phen)32+（5.0 μmol/L）孵育3 h,带正电的Ru(phen)32+发光分子通过静电吸附作用镶嵌在带负电的双链DNA中。传感器测试过程中每一步反应后都用PBS缓冲溶液洗涤。最后，将电极置于3 mL 0.1 mol/L的PBS（pH= 7.4）溶液中检测。光电倍增管高压设置为800 V，电压扫描范围为0.2~1.25 V。所构建的传感器在检测过程中，目标物Pb2+的浓度越大，修饰在电极表面的Ru(phen)32+发光分子越多，ECL信号越高。基于此，所制备的传感器实现了对Pb2+的灵敏检测。

1.5 土壤样品预处理

土壤样品的采集及处理采用以下方法。首先样品采用混合采样的方法,每个土壤采样点（10 m×10 m）先去掉约1 cm的表层土壤，再采集4处0～20 cm厚的新鲜岩土，混合后按四分法取得1kg样品。所有样品置于样品袋内带回实验室登记编号，在实验室自然风干，去除样品中杂草、沙石等杂物,通过2 mm尼龙筛（除去2 mm以上的砂砾），再用玛瑙研钵研磨后，过100目尼龙筛，混匀后保存于干燥洁净的玻璃瓶中，备用。

采用Tessier连续提取程序[10]对土壤样品进行处理。准确称取2.000 g土壤样品于100 mL的聚丙烯塑料离心管中，加入对应的提取剂，置于恒温水浴振荡器振荡提取，提取条件总结于表1。

表1 Tessier连续提取程序Tab.1 Tessier sequential extraction procedures

第1～4步提取完成后，经3000 r/min离心15 min，过滤，收集各步骤的提取液于100 mL容量瓶中，并滴加一滴浓HNO3，混匀，置于4℃冰箱中保存，备用。每次测定前用NaOH溶液调节其pH在7.0～8.0之间，并定容到100 mL。每次的残余物用10 mL去离子水洗涤3次、离心、除去上层清液，残余土壤用于下一步提取。经过1～4步的连续提取，土壤中残留的重金属已经进入土壤晶体物质的晶格中，一般的土壤环境改变难以将此部分重金属从土壤中释放出来，因此残渣态也称之为稳定态，故该实验对Pb2+的测定不包括残渣态中的Pb2+。

2 结果与讨论

2.1 纳米材料的表征

如图2所示,利用SEM对Nf-金刚石和PEI-Au的形貌进行了表征。图2（A）为Nf-金刚石的SEM图，可以看出金刚石的形貌特征，其基本颗粒为直径5～15 nm的微球，为不规则的聚集体；图2（B）为PEI-Au纳米复合物的SEM图，可以看到制得的纳米金的形貌是按照聚乙烯亚胺的树枝状形貌生长，其表面比较模糊是由于PEI分子吸附在金纳米颗粒表面所致，表明了PEIAu纳米复合物被成功制备。

图2 SEM表征:（A）Nf-金刚石和（B）PEI-Au纳米复合物Fig.2 SEM images of(A)Nf-diamond and(B)PEI-Au nanocomposites

2.2 传感器制备过程的循环伏安表征

用循环伏安法（CV）对电极逐步修饰过程中电极界面的电化学行为的变化进行了表征。不同修饰电极在 0.1 mol/L KCl的[Fe(CN)6]3-/4-（5 mmol/L，pH7.4）检测底液中进行CV扫描，如图3所示。曲线a是裸电极的CV表征曲线，可以观察到铁氰化钾良好的氧化还原峰，说明电活性探针[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面呈准氧化还原反应。当Nf-金刚石修饰在裸电极表面时，电流明显减弱（曲线b），氧化还原峰电流几乎观察不到，其原因在于电极表面形成一层带负电的Nf-金刚石膜，由于Nf的阻抗作用，使得电子传递速度降低。接下来，当PEI-Au纳米复合物修饰到电极表面，电流增强（曲线c），这是由于金纳米颗粒可以起到电子导线的作用，促进了电子传输。然后，当在电极表面孵育H0之后，可以看到电流值减小（曲线d）,这是因为DNA是生物大分子对电子传递有阻碍作用。基于以上电极修饰过程的CV曲线的变化可以很好地证明传感器的成功制备。

图3 传感器制备过程的CV表征Fig.3 CVs profiles of(a）bare GCE,(b)Nf-diamond/GCE, (c)PEI-AuNPs/Nf-diamond/GCE and(d)H0/PEI-AuNPs/ Nf-diamond/GCE in 5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-containing 0.1 mol/L KCl

2.3 传感器的分析性能

利用所制得的传感器按照1.4中所示的方法对目标物Pb2+进行定量检测，图4（A）是反应后的传感器在0.1 mol/L PBS（pH7.4）的检测底液中，在0.2~1.25 V范围内进行ECL测定得到的ECL强度vs.时间的曲线。图4（A）可以看出ECL强度随Pb2+浓度的增加而逐渐增加（曲线a～f）。且由图4（B）可知，该传感器与Pb2+浓度的对数存在明显的线性关系，线性方程为I=754.9 lgc+10152（I为电致化学发光强度，c为Pb2+的浓度），相关系数（r）为0.995。从上述线性关系可见该传感器可以很好地用于Pb2+的检测，线性范围为 1×10-12mol/L~1×10-7mol/L，检测限为3.33×10-13mol/L（由LOD=3SB/m估算而得，其中m表示标准曲线的斜率，SB表示多次空白测定的标准偏差）。结果表明，制备的该传感器具有较好的灵敏度，对Pb2+检测具有一定的潜力。

图4 （A）不同浓度的Pb2+的ECL响应信号和（B）不同浓度Pb2+的线性曲线Fig.4 (A)The ECL profiles of the prepared biosensor in the presence of different concentrations of Pb2+:(a～f): 1×10-12,1×10-11,1×10-10,1×10-9,1×10-8,and 1×10-7mol/L(from bottom to top)and(B)The corresponding calibration plot of the ECL intensity vs.the logarithm of Pb2+concentration

2.4 传感器的稳定性

稳定性是评价传感器性能的一个重要指标。为了测试该传感器的稳定性能，将孵育1.0×10-10mol/L Pb2+样品溶液的传感器在检测液中连续循环扫描一段时间，观察传感器的ECL信号变化情况。从图5中可以看到，该传感器在磷酸缓冲溶液中连续循环扫描15圈得到的电致化学发光信号相对稳定，其相对标准偏差（RSD）为9.31%。这一结果说明所构建的传感器对Pb2+的检测具有良好的稳定性。

图5 ECL信号稳定性曲线Fig.5 ECL signal stability curve

2.5 ECL传感器的选择性

为评价该传感器的选择性，选择Ni2+，Mg2+，Ca2+，K+，Ag+，Co2+，Cd2+作为干扰离子。分别检测了孵育有1.0×10-5mol/L干扰离子的传感器和1.0×10-8mol/L Pb2+的传感器的ECL信号并进行对比（干扰离子的浓度高于Pb2+浓度1000倍）。如图6所示，相对于空白样品和干扰离子而言，传感器孵育有Pb2+的溶液时，其ECL响应明显高于孵育其它离子的传感器ECL响应。同时，考虑到干扰离子浓度是目标物Pb2+浓度的100倍，该结果说明制备的传感器对Pb2+有良好的选择性。

图6 Pb2+与干扰离子ECL信号对比Fig.6 The ECL signal of Pb2+comparison with the ECL signal of interferingion

2.6 传感器用于土壤样品的检测

为进一步研究该传感器的实际应用价值，用标准加入法对传感器回收率进行了考察。将用Tessier连续提取法获得的金属离子提取液稀释50倍，然后加入不同浓度的Pb2+标准样品，并用所制得的传感器进行检测，再根据标准曲线计算浓度，所得浓度与标准浓度的比值则为回收率。如表2所示，所得回收率介于92.6%~107%之间，说明传感器对Pb2+的检测表现出良好的准确度，也体现了该传感器具有良好的实际应用价值。

表2 实际土壤样品的加标回收率实验Tab.2 Determination of Pb2+added in soil extraction solution with the proposed biosensor

3 结论

该实验结合目标物循环与杂交链式反应（HCR）信号放大策略，构建了用于检测Pb2+的“signal on”型ECL生物传感器。在目标物Pb2+存在条件下，利用目标物循环反应生成短链的DNA作为引发链，打开发夹探针H1和H2引发HCR形成双链DNA，双链DNA可以固载大量的发光试剂Ru(phen)32+，实现信号放大的目的。PEI-Au纳米复合材料不仅可以作为载体固载DNA链，还可以作为发光试剂钌的共反应试剂，增强ECL响应强度。实验结果表明，在Pb2+浓度范围为1×10-12mol/L~1×10-8mol/L之间，表现出良好的线性关系。该ECL生物传感器制备方法简单，能够对Pb2+实现高灵敏度，高选择性的检测，重现性和稳定性好，能够更方便更快速地检测低浓度的Pb2+，有望在环境监测中具有一定的应用价值。

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A sensitive“signal-on”electrochemiluminescence sensor for Pb2+based on polyethyleneimine reduced gold nanoparticles as matrix

Deng Wei1,2，Lei Yan-mei3，Xu Chang4，Qi Le1，Gou Tao-ji1，Gao Ming1*
（1.Center for Agricultural Non-point Source Pollution Control in the Three Gorges Reservoir Area,College of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400715,China)
（2.Chongqing Construction Land Affairs Center,YuZhong District,Chongqing 400015,China)
（3.Chongqing Nanomaterials and Sensing Technology Engineering Laboratory,College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)
(4.Chongqing Tobacco Monopoly Bureau,JiangBei District,Chongqing 400023,China)

In this work,combining the target cycle with the hybridization chain reaction(HCR)signal amplification, the “signal-on”electrochemiluminescence (ECL)biosensor was successfully prepared for Pb2+detection.In the presence of Pb2+,the hairpin substrate chain H0 immoblized on the electrode,which was cleaved at the RNA site owing to the the oxidative cleavage to release a DNA fragments as the primer for repetitive cycling.The DNA fragments could open hairpin structure H1,and exposes a new terminus of H1 to further react with H2 to form a long dsDNA polymer.This long dsDNA polymer can immobilize a large amount of phenanthroline ruthenium complexes (Ru(phen)32+)via electrostatic adsorption interaction.Thus,a new“signal on”ECL test method for Pb2+was developed by using PEI-Au composite nanomaterial as a new co-reactant reagent for ECL intensity enhancement. The results showed that the prepared ECL biosensor was successfully applied for the determination of Pb2+with a linear detection range of 1×10-12mol/L to 1×10-8mol/L,the detection limit was 3.33×10-13mol/L.

phenanthroline ruthenium complexes(Ru(phen)32+)；“signal on”；PEI-Au composite nanomaterial；co-reaction reagent

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD14B18）；中央高校基本业务费专项（XDJK2015D020）

*通信联系人,E-mail:gaoming@swu.edu.cn