基于鲁米诺修饰AuAg@MnO2纳米复合材料构建的β淀粉样蛋白电致化学发光免疫传感器的研究

王靖茜，朱阿敏，袁 若，柴雅琴

（重庆市现代分析化学重点实验室，西南大学化学化工学院，重庆400715）

基于鲁米诺修饰AuAg@MnO2纳米复合材料构建的β淀粉样蛋白电致化学发光免疫传感器的研究

王靖茜，朱阿敏，袁 若*，柴雅琴*

（重庆市现代分析化学重点实验室，西南大学化学化工学院，重庆400715）

该文以电致化学发光（ECL）物质鲁米诺作为还原剂制备了鲁米诺功能化的金银纳米颗粒（Lum-AuAgNPs），并将其成功固载到二氧化锰纳米颗粒（MnO2NPs）的表面，制备了一种新的纳米复合材料Lum-AuAg@MnO2。该复合材料具有较低的生物毒性，极大的比表面积和良好的电催化能力，可以用作蛋白质的纳米载体构建生物传感器。文中以该材料为二抗（Ab2）载体制备了一个能够高灵敏检测阿兹海默症标志物β淀粉样蛋白（Aβ）的夹心型ECL免疫传感器。由于Lum-AuAg@MnO2具有良好的导电性和过氧化氢催化活性，能够有效提高luminol-H2O2体系的电化学发光效率，进而检测到较强的ECL信号。实验表明，该传感器在β淀粉样蛋白抗原的测定上有良好的线性关系，线性范围为100 ng/mL～1 pg/mL，最低检测限为0.33 pg/mL。该传感器对Aβ的检测具有灵敏度高、检测范围宽、制作简便、成本低的优点，并且具有良好的选择性和重现性。

电致化学发光；β淀粉样蛋白（Aβ）；鲁米诺；免疫传感器

0 引言

免疫是人体的一种生理功能，它能够对进入人体的异物进行有效的识别，通过人体产生的抗体（antibody）对有害异物进行排斥和破坏，以此维持人体的健康。这类能够引起免疫反应的异物被称为抗原（antigen），通常能与之对应的抗体特异性地结合在一起。正是基于生物体内抗原与抗体之间的特异识别功能，Henry等[1]提出了免疫传感器（immunosensor）的概念，免疫传感器结合了高灵敏的传感换能技术与特异性免疫反应，将抗原与抗体的识别转化成为可被直观检测的物理化学信号[2]。在测定过程中根据是否使用了标记物免疫传感器可以分为直接型和间接型的免疫传感器：直接型免疫传感器是抗体直接与抗原结合，从而实现对抗原的检测；间接型是基于捕获抗体（capture antibody,Ab1）、被测抗原（antigen, Ag）以及标记抗体（secondary antibody,Ab2）构建夹心免疫模式进行免疫分析，其抗原分子表面至少存在两个抗原决定簇，能先后与两个抗体结合，形成夹心模式，通过抗体上的信号标记物产生并放大免疫反应信号，提高检测灵敏度。与传统的免疫测试相比，免疫传感器集免疫反应、信号产生、信号检测一体化，具有结构紧凑、灵敏度高、使用方便、成本低等特点。它将不断推动传统免疫测试的发展，并对临床和环境监测等领域做出贡献[3]。

电致化学发光（Electrochemiluminescence,简称ECL）是指通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流，在电极表面生成某些物质，这些物质之间或者与体系中的其他组分通过电子传递生成激发态，当激发态跃迁回基态时产生的发光现象。电致化学发光分析结合了电化学分析和化学发光分析两种分析技术的优点，在检测过程中可同时测定电解电流强度和发光强度，具有高的灵敏度和选择性、宽的线性范围以及较强的抗干扰能力[4]。

1928年Albercht发现鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼）在碱性条件下发光，这对于有机化学发光具有里程碑的意义[5]。鲁米诺因结构简单、水溶性好、易制备、发光量子产率高而被广泛研究[6]。鲁米诺在碱性的条件下可被过氧化氢、高锰酸钾、溶解氧等氧化剂氧化，氧化产物由激发态跃迁回基态时会产生化学发光。在实际的试验研究中，研究者常用过氧化氢（H2O2）作为鲁米诺的氧化剂，从而构建鲁米诺-过氧化氢发光体系。在鲁米诺-过氧化氢体系中，过氧化氢被催化分解生成大量的羟基自由基（OH·）和超氧自由基（O2-·），在发光过程中起着关键的作用[7]。其中，过氧化氢酶是一种非常常见的过氧化氢生物催化剂，它能够很好地催化过氧化氢的分解，从而产生大量的活性氧，极大地促进鲁米诺的发光效率。但是，过氧化氢酶仍然存在一些不足：需要低温储藏，对环境pH等要求苛刻。近年来，为了克服过氧化氢酶的弱点，贵金属和金属氧化物纳米材料[8]作为一种新的氧化还原反应催化剂参与鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光，如金纳米粒子（AuNPs）、银纳米粒子（AgNPs）、氧化锌纳米粒子（ZnO NPs）、二氧化锰纳米粒子（MnO2NPs）等，显著放大了鲁米诺的ECL信号。崔华实验组利用鲁米诺作为还原剂制备了鲁米诺功能化的纳米金颗粒[9]，实现了鲁米诺在纳米材料表面的固载，提高了鲁米诺的使用效率和发光效率。由此，基于ECL和免疫传感器的优点，该文课题组构建了一个以鲁米诺为信号物质的电致化学发光免疫传感器（ECL Immunosensor）。

阿尔兹海默症 （Alzheimer’s disease，简称AD）是由神经病理学家阿尔兹海默发现，并以其名字命名，这是一种主要发生在老年人群中的神经变性疾病，最显著的临床特征为记忆退化、认知及运动功能产生障碍等[10]。伴随着全球人口的老龄化，阿尔茨海默病的发病率逐渐上升，因此对阿兹海默症的及早发现具有十分重要的意义。关于阿尔兹海默症的发病机理有很多种学说，其中Hardy等提出的阿尔兹海默症是由于β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，简称Aβ）的级联假说引起的关注度最高。该学说认为Aβ的聚集在阿尔兹海默症的发生、发展过程中起着关键作用[11]。

该次实验中，构建了一个能够高灵敏检测Aβ的ECL免疫传感器。首先，在PDDA（聚二烯丙基二甲基氯化铵）功能化的MnO2NPs表面利用静电吸附固载鲁米诺功能化的 AuAgNPs（Lum-AuAg@MnO2），并将其作为二抗（Ab2）纳米载体。同时这种纳米复合材料也是一种极好的过氧化氢酶类似物，表现出了极好的H2O2催化性能。H2O2分解产生的羟基自由基（OH·）和超氧自由基（O2-·）与材料表面的鲁米诺反应，产生强的ECL信号。其次，二抗通过Au-N键被固载在Lum-AuAg@MnO2表面，从而制备了ECL二抗信号探针（Ab2@Lum-AuAg@MnO2）。最后，捕获抗体（Ab1）被固载在沉积金修饰的玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）上，构建了该传感器的传感界面。该实验的目标物Aβ介于Ab1和Ab2@Lum-AuAg@MnO2之间构建夹心模式，实现了对Aβ的超灵敏检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）；FA-2004A FA/JA系列电子天平（Metter Toledo公司）；CHI 660A型电化学工作站（上海辰华仪器公司）；SB-80超声清洗仪 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；移液枪 （成都方舟科技开发公司）；SZCL-3B磁力搅拌器。

β淀粉样蛋白（Aβ）及其对应抗原（anti-Aβ）（上海信裕生物科技有限公司），Mn(CH3CHOO)2（天津市福晨化学试剂厂），高锰酸钾（KMnO4）（成都市科龙化工试剂厂），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)、壳聚糖、牛血清白蛋白（BSA 96%~ 99%）、聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）均购于Sigma-Aldrich，氯金酸（HAuCl4）(上海)，铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]），磷酸缓冲溶液（PBS，0.1 mol/L，pH7.4）是由0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L KH2PO4和0.1 mol/L KCl混合配制而成，其他试剂均为分析纯试剂，实验用水为二次去离子水。

1.2 MnO2纳米颗粒的合成

5 mL新制的Mn(CH3CHOO)2溶液（0.03mol/L）加入到50 mL洁净烧杯中，并用去离子水稀释至20 mL，在搅拌条件下往溶液中慢慢滴加约1 mL新制的KMnO4溶液（0.02 mol/L），搅拌1 h。然后往溶液中分别缓慢滴入1 mL氨水和1 mL PDDA（与水体积比1∶3），继续搅拌6 h。最后将制得的黑色沉淀用去离子水离心洗涤至中性，得到的MnO2纳米颗粒分散在去离子水中储存备用。

1.3 Lum-AuAg@MnO2的制备

首先，取1 mL MnO2分散液稀释至20 mL，分别加入 200 μL 1%的 HAuCl4和 500 μL 0.025 mol/L luminol溶液，在100℃条件下搅拌6 h。然后向混合液中加入200 μL 1%的AgNO3溶液，在100℃条件下继续搅拌6 h。最后将制得的物质用去离子水洗涤3次，得到的Lum-AuAg@MnO2分散在去离子水中并储存在4℃下备用。

1.4 二抗复合物 （Ab2@Lum-AuAg@MnO2）的合成

向2 mL Lum-AuAg@MnO2分散液中加入40 mmol/L的EDC和10 mmol/L的NHS[12]，并加入100 μL anti-Aβ，在4℃条件下搅拌8 h。然后加入100 μL的BSA（1%）搅拌4 h用以封闭材料表面的非特异性结合位点。最后将制得的二抗复合物用去离子水洗涤，用于洗掉未能与材料结合的多余抗体和BSA，得到的Ab2@Lum-AuAg@MnO2被分散在2 mL PBS（0.1 mol/L，pH7.4）中并储存在4℃条件下备用。

1.5 电化学发光免疫传感器的制备

电化学发光免疫传感器的制备过程如图1所示。将玻碳电极分别用粒径为0.3和0.05 μm的Al2O3粉抛光后用去离子水清洗，在室温条件下风干待用。将处理好的玻碳电极置于氯金酸溶液（1%）中，在-0.2 V条件下静电位沉积30 s，获得修饰有沉积金的玻碳电极（DpAu/GCE）。其次将10 μL Ab1滴在电极表面，在4℃条件下放置12 h，使Ab1通过Au-N键固载到电极表面。然后用去离子水洗去多余的Ab1，并将10 μL 1%的BSA加在电极表面，在常温下孵育1 h以封闭电极表面的非特异性位点，减少非特异性吸附。最后，用去离子水洗去多余的BSA，并将不同浓度的Aβ滴加在电极表面，在室温下孵育1 h，制备得到免疫传感器，并储存在4℃下备用。

1.6 ECL检测

将制备好的Ab2@Lum-AuAg@MnO2滴加在修饰好的电极表面，室温下孵育1 h。然后用去离子水洗去未参与免疫反应的 Ab2@Lum-AuAg@MnO2，然后在电极表面滴加5 μL壳聚糖室温放置自然晾干成膜。已经形成夹心结构的免疫传感器在2 mL PBS（pH8.0，含有2.5 mmol/L H2O2）中检测发光信号。检测过程中光电倍增管（PMT）的光电倍增高压设置为800 V，工作电压扫描范围设置为0～0.6 V，扫描速率为100 mV/s。

图1 免疫传感器的制备过程示意图Fig.1 Schematic diagram of the stepwise immunosensor construction process

2 结果与讨论

2.1 电致化学发光免疫传感器修饰过程的特性表征

修饰有不同物质的玻碳电极置于铁氰化钾溶液（5 mmol/L）中，在-0.2～0.6 V的电位范围内进行循环伏安的电化学表征。结果如图2(A)所示：a曲线是裸电极的CV表征曲线；当裸电极表面沉积了纳米金后，由于纳米金具有极好的导电性，加快了电子的传递速率，使CV电流增强（b曲线）。当anti-Aβ修饰到电极表面后，因为蛋白质分子阻碍了电子的传递，使CV电流与b曲线相比减弱（c曲线）。然后，BSA被滴加到电极表面用于封闭传感器界面的非特异性吸附位点，CV信号进一步降低（d曲线）。滴加Aβ后，由于Aβ与anti-Aβ发生特异性反应，电极界面阻碍电子传递的蛋白质分子进一步增多，电子传递速率下降，信号继续减弱（e曲线）。综上所述，该传感器的修饰过程符合实验预期。

图2 （A）CV表征（a.裸电极，b.纳米金/裸电极，c.anti-Aβ/纳米金/裸电极，d.BSA/anti-Aβ/纳米金/裸电极，e.Aβ/BSA/anti-Aβ/纳米金/裸电极）（B）ECL表征（红色曲线：Ab2/Aβ/BSA/anti-Aβ/纳米金/裸电极，黑色曲线：Aβ/BSA/anti-Aβ/纳米金/裸电极）Fig.2 （A）The characterization of CV(a.bare GCE,b.DpAu/GCE,c.anti-Aβ/DpAu/GCE,d.BSA/anti-Aβ/DpAu/ GCE,e.Aβ/BSA/anti-Aβ/DpAu/GCE)（B）The characterization of CEL(The red curve：Ab2/Aβ/BSA/anti-Aβ/DpAu/GCE，The black curve：Aβ/BSA/anti-Aβ/DpAu/GCE)

为了证明发光物luminol成功固载到了二抗复合物，并且该复合物能够形成夹心免疫模式。该实验将孵育有Ab2和没有孵育Ab2的免疫传感器分别置于2 mL PBS（pH8.0，含有2.5 mmol/L H2O2）中检测发光信号。结果如图2（B）所示：修饰有Ab2得到的红色曲线ECL信号值明显高于无Ab2的黑线，表明成功地将luminol固载到Ab2上并构建了夹心模式免疫传感器。

2.2 SEM表征

图3为SEM表征二抗复合物纳米载体（Lum-AuAg@MnO2）的合成过程，图3（A）为二氧化锰纳米颗粒的表面形态，从图中可看出二氧化锰纳米颗粒呈四边形颗粒，表面光滑，粒径大约50 nm。图3（B）可看出许多颗粒状的金银合金吸附在二氧化锰表面，呈现出了较大比表面积。由此，可以看出鲁米诺修饰的金银纳米合金成功地包裹在二氧化锰纳米表面形成了二抗复合物纳米载体。

图3 SEM表征（A：二氧化锰纳米颗粒，B：包裹了鲁米诺修饰的金银合金的二氧化锰纳米复合材料）Fig.3 The characterization of SEM(A:MnO2NPs,B:Lum-AuAg@MnO2NPs)

2.3 传感器的性能优化

检测底液中的H2O2浓度对免疫传感器的分析性能有重要的影响。如图4（A）所示，随着H2O2浓度增加到2.5 mmol/L时发光强度增加明显，然后趋于平稳水平。因此 H2O2最佳浓度为 2.5 mmol/L。

图4 （A）H2O2浓度对免疫传感器发光强度的影响；（B）Ab2孵育时间对免疫传感器发光强度的影响Fig.4 (A)Effects of H2O2concentration on ECL intensity of the immunosensor;(B)Effects of Ab2incubation time on ECL intensity of the immunosensor

免疫电极在构建过程中孵育时间是另一个重要影响因素，孵育时间主要由Aβ和Ab2之间的时间决定。将Aβ的浓度定为1 ng/mL，分别检测Ab2孵育不同时间的ECL。如图4（B）显示，在孵育时间为1 h时测得了最高的ECL强度，然后趋于平稳水平。因此最佳时间为1 h。

2.4 ECL信号响应特性

在最优条件下，电极表面修饰不同浓度的Aβ溶液，于2 mL PBS（pH8.0，含有 2.5 mmol/L H2O2）的底液中，在0～0.6 V范围内进行ECL表征，结果如图5所示。实验结果表明，随着Aβ浓度的升高，ECL信号也明显升高，并且在0.001～100 ng/mL的浓度范围，ECL响应信号与Aβ浓度的对数成线性关系。其线性回归方程为：I= 5203.62+805.57 lgc（c为Aβ的浓度），相关系数为r2=0.9938。

图5 ECL信号（Aβ溶液的浓度分别为a.100 ng/mL，b.10 ng/mL，c.1 ng/mL，d.100 pg/mL，e.10 pg/mL，f.1 pg/mL，g.0 pg/mL）Fig.5 ECL signal(Aβ solution concentration were a.100 ng/mL,b.10 ng/mL,c.1 ng/mL,d.100 pg/mL, e.10 pg/mL,f.1 pg/mL,g.0 pg/mL)

2.5 Aβ免疫传感器的选择性和稳定性

为研究Aβ免疫传感器的选择性，该实验使用甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）作为干扰物质，在传感器表面分别孵育AFP（1 ng/mL），CEA（1 ng/mL）以及Aβ（0.1 ng/mL）。从图6（A）可以看出，孵育AFP和CEA的传感器测得较低的ECL信号，而孵育有目标物Aβ的传感器则可以测得高的ECL信号。同时，实验中还将三种蛋白的混合溶液 （1 ng/mL CEA，1 ng/mL AFP，0.1 ng/mL Aβ）修饰到传感器表面，检测到的ECL信号与0.1 ng/mL浓度的Aβ十分接近，表明该ECL免疫传感器对Aβ具有良好的选择性。

图6 （A）Aβ免疫传感器的选择性；（B）Aβ免疫传感器的稳定性Fig.6 (A)The selectivity of Aβ immunosensor;(B)The ECL stability of Aβ immunosensor

为了考察电化学发光免疫传感器的稳定性，将孵育了0.1 ng/mL浓度的Aβ的电极在2 mL PBS（pH8.0，含有2.5 mmol/L H2O2）的底液中连续扫描了12圈。结果如图6（B）所示，ECL响应值的相对标准偏差（RSD）为2.16%，说明该传感器具有良好的稳定性。

2.6 实际样品的检测

采用标准添加法，利用被PBS（pH7.4）稀释40倍的人体血清液配置一系列不同浓度的Aβ溶液，在这种模拟人体环境中检测ECL传感器的性能。测得的ECL免疫传感器响应信号，结果如表1所示，显示加标回收率在96.5%～103.5%范围内，证明该免疫传感器可以应用于实际样品的检测。

表1 不同浓度Aβ样品的检测Tab.1 Determination of Aβ added in normal human serum with the proposed aptasensor

3 结论

在该研究中，以Lum-AuAg@MnO2纳米复合材料作为Ab2的纳米载体，成功地构建了一种用于超灵敏检测β淀粉样蛋白的免疫传感器。该实验制备了Lum-AuAg@MnO2纳米复合材料并将其用于基于鲁米诺为发光物的ECL免疫传感器的构建。在Luminol-H2O2体系中，MnO2NPs作为一种酶类似物对H2O2的分解有极好的催化性能，催化产生的活性氧能够极大的提高鲁米诺的发光性能。AuNPs和AgNPs的存在也能够很好地促进鲁米诺的发光，从而得到高的ECL信号。该实验结果表明，该免疫传感器制备方法简单，有着较好的选择性，能够检测血清中的β淀粉样蛋白抗原浓度，有望应用于β淀粉样蛋白抗原的医学研究和临床检验。

[1]范瑾瑾,霍纪文.电化学免疫传感器测定Ag-Ab反应[J].国外医学临床生物化学与检验学分册,1995,16 (4):159.

[2]North J.Immunosensors:Antibody-based Biosensors[J]. Trends Biotechnol.,1985,3:180.

[3]温志文.免疫传感器的发展概述 [J].生物医学工程学杂志,2001,18(4):642-646.

[4]王晓英.基于电致化学发光技术的纳米生物传感器的设计与研究[D].上海:华东师范大学,2008.

[5]Albrecht H O.Chemiluminescence of Aminophthalic Hydrazide[J].Z.Phys.Chem.,1928,136:321-330.

[6]王冬梅.无机碳、硒纳米颗粒催化鲁米诺化学发光反应机理研究[D].重庆:西南大学,2013.

[7]Merenyi G,Lind J S.Role of A Peroxide Intermediate in the Chemiluminescence of Luminol A Mechanistic Study [J].J.Am.Chem.Soc.,1980,102(18):5830-5835.

[8]吴亮,沐春磊,张群林.纳米颗粒参与的鲁米诺化学发光及其分析应用[J].化学进展,2013,25(7):1187-1197.

[9]Cui H,Wang W,Duan C F,et al.Synthesis,Characterization,and Electrochemiluminescence of Luminol-Reduced Gold Nanoparticles and Their Application in a Hydrogen Peroxide Sensor[J].Chem.Eur.J.,2007,13: 6975-6984.

[10]胡海燕.β-淀粉样蛋白在阿尔茨海默病中的作用及中药多靶点对抗研究进展[J].中华中医药学刊,2012, 30(3):489-491.

[11]应侠,吴振.阿尔兹海默症的病发机制及治疗药物研究进展[J].中国药房,2014,25(33):3152-3155.

[12]Wang J X,Yuan R,Chai Y Q,et al.Electrochemiluminescence immunosensor based on multifunctional luminol-capped AuNPs@Fe3O4nanocomposite for the detection of mucin-1[J].Biosens.Bioelectron.,2015,71: 407-413.

Luminol-capped AuAg@MnO2nanocomposite based electrochemiluminescence immunosensor for the detection of βamyloid protein

Wang Jing-xi,Zhu A-min,Yuan Ruo*,Chai Ya-qin*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

In this work,the electrochemiluminescence (ECL)luminophore of luminol was utilized as reductant to synthesize luminol functionalized gold-silver nanoparticles (Lum-AuAgNPS).And the Lum-AuAgNPs were immobilized on the surface of MnO2NPs with low bio-toxicity,large specific surface area,and favourable chemical catalytic activity(Lum-AuAg@MnO2),which could be used as protein carrier to fabricate biosensors.Encouraged by the advantages above,a sandwiched electrochemiluminescence(ECL)immunosensor based on Lum-AuAg@MnO2was constracted for ultrasensitive detection of β-amyloid protein(Aβ,a biomarker for Alzheimer’s disease).Lum-AuAg@MnO2exhibited excellent conductivity and admirable catalytic activity in H2O2decomposition,which could increase the ECL efficiency of luminol-H2O2system and generate strong ECL signal.The experiment proved that the immunosensor had good linear range of 100 ng/mL to 1 pg/mL and an ultralow detection limit of 0.33 pg/mL in the determination of β-amyloid protein,exhibiting high sensitivity and controllable reaction in Aβ detection.

electrochemiluminescence;β-amyloid protein(Aβ);luminol;immunosensor

国家自然科学面上基金项目（21575116,21675129,21675130）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（XDJK2015A002）

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