壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯（CS-PB-GR）复合物用于高灵敏电化学免疫传感器研究

苏会岚,张瑞林

（成都医学院公共卫生系,四川成都610500）

壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯（CS-PB-GR）复合物用于高灵敏电化学免疫传感器研究

苏会岚*,张瑞林

（成都医学院公共卫生系,四川成都610500）

合成了CS-PB-GR复合物，并将其修饰在玻碳电极表面，通过共价作用结合Pt/Au纳米合金，进一步固载甲胎蛋白（AFP抗体），采用HRP进行封闭，构建高灵敏电化学免疫传感器。采用示差脉冲伏安法（DPV）和循环伏安法（CV）对电极修饰过程及响应性能进行研究。在最佳实验条件下，电流响应值与AFP浓度在0.1~200 ng/mL的范围内呈线性关系，检出限为0.03 ng/mL，具有重现性、稳定性好的特点，可实现对免疫分子的高灵敏检测。

石墨烯；普鲁士蓝；电化学免疫传感器；甲胎蛋白

0 引言

原发性肝癌（PHC）早期症状不明显，临床上发现时多处于中晚期，且疾病发展迅速，治疗困难，预后差。有效的早期诊断是提高患者5年生存率的重要手段。甲胎蛋白（AFP）是临床上原发性肝癌早期诊断、疗效观察和预后判断的重要指标。因此，建立一种简便、快速、灵敏度高、重现性好、成本低的检测方法对肝癌的早期筛查和预后判断具有重要的现实意义。而电化学免疫传感器因其具有灵敏度高、分析速度快等优点，在肿瘤标志物的检测中被广泛关注。

电化学免疫传感器的信号通常是通过将电活性物质固定在电极表面或放入检测底液中来指示电信号变化的。普鲁士蓝（PB）是电化学分析过程中常用的电活性物质，在传感器构建中可通过包埋、电沉积及制备纳米材料等方式将其修饰在电极表面，但普鲁士蓝在传感界面上易脱落，导致免疫传感器的稳定性降低[1-2]。2010年诺贝尔物理学奖授予了石墨稀的发现者Andre Geim和Konstantin Novoselov教授，使石墨烯作为一种新型纳米材料登上材料科学的舞台。石墨烯具有高的比表面积(2630 m2/g)、强导电性(103～104 S/m)、高韧性等特点，在电化学免疫传感器的研究中可用于增大电极比表面积和提高电极表面的电子传输能力[3-6]，基于石墨烯的复合纳米材料因其具有各材料的协同效应也引起广泛关注[7]。基于此，该研究制备了基于壳聚糖（CS）-普鲁士蓝（PB）-石墨烯（GR）（CS-PB-GR）复合物的AFP免疫传感器，通过Pt/Au纳米合金、辣根过氧化酶（HRP）、PB对底物过氧化氢的催化作用放大响应信号。该研究优化了实验条件，并对该免疫传感器的电化学特性及其响应性能进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

EC 6800电化学分析仪 （上海舜宇恒平科学仪器有限公司），78AW-1恒温磁力搅拌器（江苏省金坛市医疗仪器厂），S04H超声波清洗仪 （致微仪器有限公司），低速离心机（科大创新股份有限公司），PHS-320PH计，优普超纯水制造系统（四川优普超纯科技有限公司）。AFP甲胎蛋白诊断试剂盒购于郑州博赛生物技术股份有限公司，HRP、氯铂酸、氯金酸、壳聚糖购于将来实业，石墨烯购于先丰纳米。

1.2 免疫传感器的制备

1.2.1 CS-PB-GR的制备

准确称量六水合氯化亚铁6.000 mg，铁氰化钾8.000 mg，氯化钾37 mg，用5 mL超纯水溶解，调节pH至1.5。将1 mg/mL GR加入上述溶液中，搅拌24 h，离心洗涤，即得PB-GR复合物。将1 mL 1 mg/mL的CS悬浮液加到PB-GR溶液中，搅拌，洗涤，分散于蒸馏水中。

1.2.2 Pt/Au的制备

将1 mL 1%的氯金酸溶液加入到100 mL搅拌中的沸水，迅速加入1.5 mL柠檬酸钠（1%），20 min后，再向其中依次加入维生素C溶液和氯铂酸（1%），继续加热30 min即得Pt/Au纳米合金。

1.2.3 免疫传感器的制备

用α-氧化铝抛光粉将玻碳电极打磨抛光，然后分别用无水乙醇和超纯水超声清洗。氮气吹干后，滴加10.0 μL CS-PB-GR复合物，晾干。将上述电极在纳米Pt/Au复合液中浸泡6 h，然后放于4℃冰箱中保存备用。

1.3 免疫传感器检测原理及方法

采用示差脉冲伏安法（DPV）和循环伏安法（CV）对免疫传感器进行表征。以修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。扫描电位区间为-0.2~0.8 V，扫速为50 mV/s。测试底液为磷酸缓冲溶液PBS。

2 结果与讨论

2.1 免疫传感器制备过程的电化学表征

采用DPV研究了免疫传感器制备过程的电化学行为（图1）。从图1可知，GCE表面修饰上一层CS-PB-GR后，可以观察到PB的特征峰（曲线a），此时连续扫描30圈，其峰电流基本不变，说明壳聚糖具有良好的成膜性，可稳定的修饰在电极表面。在电极表面共价修饰上Pt/Au纳米合金后，峰电流明显升高（曲线b），这是由于Pt/Au纳米合金提高了电极表面的电子传输效率。进一步通过Pt/Au对蛋白质的共价吸附作用，修饰上anti-AFP，由于蛋白质的电化学惰性使峰电流明显下降 （曲线c），最后用HRP封闭GCE表面的非特异性吸附位点，峰电流进一步减小（曲线d），说明该免疫传感器得以成功构建。

图1 不同修饰电极的DPV表征图：（a）CS-PB-GR/ GCE;（b）Pt/Au/CS-PB-GR/GCE；（c）anti-AFP/Pt/Au/CSPB-GR/GCE；（d）HRP封闭Fig.1 DPV of different electrodes:（a）CS-PB-GR/GCE;（b）Pt/Au/CS-PB-GR/GCE；（c）anti-AFP/Pt/Au/CS-PBGR/GCE；（d）HRP block

2.2 免疫传感器电化学特性

为了研究该免疫传感器的电子传递过程，用循环伏安法测试了其在50~300 mV/s扫速下的循环伏安响应情况（图2）。由图2可知，随着扫速的不断增加，氧化还原峰均不断增大。由插图可知，氧化还原峰电流的增大与扫速成正比，可说明该氧化还原行为由表面控制。

图2 传感器在不同扫速（mV/s）下的循环伏安图（a）50（b）100（c）150（d）200（e）250（f）300（插图：氧化还原峰电流与扫速的关系）Fig.2 CVs of the modified electrode at scan rate of(from inner to outer):（a）50（b）100（c）150（d）200（e）250（f）300 mV/s;Inset:plot of peak current vs scan rate

2.3 实验条件优化

2.3.1 pH优化

实验用循环伏安法探讨了不同pH对免疫传感器响应的影响。由图3可知，当测试底液的pH从4.5到7.0变化，氧化还原峰电流均随之增大。由于低pH会降低蛋白质的分子活性，并且对PB的电化学响应也有影响，而过高的pH又会降低免疫传感器的灵敏度。因此，实验选择pH7的PBS作为测试底液。

图3 测试底液pH对免疫传感器的影响Fig.3 the CVs of the modified electrode in detection solution with different pH

2.3.2 孵育时间优化

特异性免疫识别完成程度与免疫反应的时间有关。实验采用循环伏安法将制备好的免疫传感器在AFP抗原溶液中分别孵育5、8、10、12、18、20 min，其响应电流随孵育时间增加而降低（图4）。当孵育时间为12 min以后，电流变化不明显，表明12 min时免疫反应完全。故实验选用12 min为孵育时间。

2.3.3 底物催化对免疫传感器的信号增强作用

实验研究了H2O2对免疫传感器响应电流的增强效应。将制备好的电极与2.5 ng/mL AFP孵育，研究测试底液中H2O2对传感器响应的影响。结果显示，加入4 mmol/L H2O2后，响应电流增加14 μA，证明该免疫电极对H2O2有明显的催化作用。

图4 孵育时间对免疫传感器的影响Fig.4 the effect of incubation time on the response of the biosensor

2.4 免疫传感器响应性能研究

将制备好的免疫传感器在最优条件下与不同浓度的AFP抗原溶液孵育，测定传感器响应电流与AFP浓度之间的关系，结果如图5所示。由图中可以看出，随着AFP浓度增加，传感器上的免疫复合物也越多，使其氧化还原峰电流逐渐减小，抗原浓度在0.1~200 ng/mL范围内与响应值成正比，检测限为0.03 ng/mL。

图5 AFP抗原浓度与响应电流之间的关系Fig.5 linear relationship between the peak current and concentration of AFP

2.5 免疫传感器其他性能研究

2.5.1 选择性

实验将免疫传感器分别与100 ng/mL AFP抗原、100 ng/mL AFP抗原与干扰物质 （100 ng/mL的癌胚抗原、25 ng/mL HRP、0.25%的牛血清白蛋白）等体积混合液孵育。结果显示，免疫传感器在混合样品与相同浓度AFP的标准品种的响应基本相同，说明干扰物对响应信号的干扰很小，证明该传感器的选择性良好。

2.5.2 重现性

实验用 5只免疫传感器同时与 20 ng/mL AFP抗原孵育，测定5只免疫传感器对相同浓度抗原的响应差异。结果显示，5只免疫传感器的响应电流的相对标准偏差为4.8%，证明该免疫传感器具有良好的重现性。

2.5.3 稳定性

实验对该免疫传感器的稳定性开展研究。将免疫传感器与5 ng/mL AFP抗原孵育后4℃保存。每5 d测试一次，连续测试5次。结果表明，响应电流标准偏差为2.9%，说明该免疫传感器具有良好的稳定性。

3 结论

该研究采用超声合成法制备了CS-PB-GR复合物，有效提高了PB在电极表面的稳定性。同时，利用壳聚糖的良好成膜性及生物相容性，可使该复合物稳定的修饰在电极表面。另外，GR的掺杂可有效增大电极的比表面积，同时利用GR的强导电性可有效提高电极敏感膜的导电性能，提高电子传输效率，增强检测灵敏度。同时，采用化学合成法制备了Pt/Au纳米合金，基于氨基共价作用将anti-AFP抗体固定在传感器界面，用HRP封闭非特异吸附位点，制得免疫传感器。该免疫传感器中，Pt/Au纳米合金、HRP、PB对过氧化氢的氧化还原具有催化作用[8-10]，在测试底液中加入过氧化氢，可获得明显增强的电流响应信号，实现对甲胎蛋白的高灵敏检测。在最优实验条件下，该文采用甲胎蛋白为免疫分析模型，对传感器的性能进行了研究。结果显示，该传感器电极响应的电流值与AFP浓度在0.1~200.0 ng/mL的范围内呈线性关系，检出限为0.03 ng/mL，在免疫分子的高灵敏检测中有广泛的应用前景。

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High sensitive electrochemical immunosensor based on the conductive composites:chitosan-prussian blue-graphene(CS-PBGR)

Su Hui-lan*，Zhang Rui-lin
（The department of public health,Chengdu medical college,Chengdu 610500,China）

The synthesis of chitosan-Prussian blue-graphene(CS-PB-GR)was conducted firstly,followed by the colvantly linked Pt/Au nanomaterials.Then,anti-AFP could be absorbed to the electrode surface by the reaction between Au and amino.After HRP blocked,the electrochemical immunosensor was prepared successfully,which were demonstrated by differential pulse voltammetry(DPV)and cyclic voltammetry(CV).The effects of experimental parameters and the performance of the biosensor were also been investigated.under the optimal experiment conditions,the prepared immunosensor displayed a liner relationship between 0.1~200 ng/mL with a detection limit of 0.03 ng/mL.The proposed immunosensor could be used for the detection of immune molecular with high sensitivity,good stability and selectivity.

graphene;prussian blue;electrochemical immunosensor;AFP

国家自然科学基金（81401757），发育与再生四川省重点实验室项目（SYS16-004）

*通信联系人,Tel：028-62739576，E-mail：suhuilan1986@163.com