铁皮石斛茎段离体培养一次成苗技术研究

琚淑明，朱伟玲，王伟亮，高 云，马涛

(1.徐州工程学院，江苏 徐州　221000，2.徐州珍稀植物快速繁育工程技术中心，江苏 徐州　221000)



铁皮石斛茎段离体培养一次成苗技术研究

琚淑明1,2，朱伟玲1，王伟亮1，高 云2，马涛2

(1.徐州工程学院，江苏 徐州221000，2.徐州珍稀植物快速繁育工程技术中心，江苏 徐州221000)

摘要：【目的】 简化铁皮石斛繁育流程，缩短育苗周期.【方法】 以铁皮石斛茎段为外植体，研究了铁皮石斛茎段组织培养一次成苗技术.【结果】 70%的乙醇30 s+1‰升汞10 min消毒效果较好,外殖体污染率为43%,诱导率达97%；一次成苗培养基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L+琼脂7‰+蔗糖25 g/L增殖及生长情况最好；在该组培系统中铁皮石斛适宜的继代周期为50 d，成苗率100%，平均根数5.4，繁殖系数5.6；铁皮石斛丛生芽移栽以腐叶土和腐叶土∶河沙(1∶1)两种基质的成活率高，且生长健壮.【结论】 本技术简化了铁皮石斛组培工艺流程，缩短了育苗周期，降低了生产成本，适用于规模化生产.

关键词：铁皮石斛；茎段；组织培养；一次成苗

铁皮石斛(Dendrobiumcandidum)兰科石斛属多年生附生草本植物，是一种名贵珍稀中药材，同时具有极高的观赏价值[1].铁皮石斛野生资源由于过度采挖及生境恶化已濒临灭绝[2].近年来，为了满足市场需求，铁皮石斛实现了规模化生产，种苗主要通过组织培养技术快速繁殖获得[3].组织培养一次性成苗技术是用一种培养基完成整个成苗过程，得到符合出甁标准的小苗，避免了诱导、增殖、生根3个阶段中使用不同的培养基，从而极大地简化了组织培养流程.铁皮石斛组织培养研究中，以种子为外植体的一次成苗研究较多[4-5]，而以茎段为外植体的一次成苗技术研究鲜有报道.但铁皮石斛适宜作外植体的种子可获得量少，难以满足生产需求.本研究以茎段为外植体材料，进行一次成苗技术研究，旨在简化工艺流程，缩短育苗时间，降低育苗成本,筛选出铁皮石斛一次成苗的适宜培养基，以推进铁皮石斛产业化进程.

1材料与方法

1.1材料

铁皮石斛为云南省农业科学院赠送.选取健康铁皮石斛植株，以茎段为外植体.

1.2试验设计

1.2.1无菌苗的获得铁皮石斛植株流水冲洗1 h，取长0.5～0.8 cm带节茎段，去除叶片保留叶鞘.采用常规消毒技术，设70%乙醇30 s+1‰ 升汞80 min，70%乙醇30 s+1‰升汞10 min和70% 乙醇+1‰ 升汞15 min 3个消毒处理(表1).蒸馏水冲洗4～5次，接种30 d，统计污染率，诱导及生长情况.

1.2.2一次成苗培养基激素筛选以1/2MS为基本培养基，以无菌苗为材料，截取0.5～0.8 cm的带节茎段，接种在不同的培养基上，共6个处理，接种外植体培养45 d，统计不定芽增殖及生根情况，筛选适宜的激素种类及浓度(表2).

1.2.3一次成苗基础培养基筛选以无菌苗为材料，截取0.5～0.8 cm的带节茎段，以MS和1/2MS为培养基分别添加NAA 0.5 mg/L和6-BA 3 mg/L，共2个处理，接种外植体培养45 d，统计不定芽增殖及生根情况，筛选适宜的基础培养基(表3).

1.2.4组培苗培养条件温度(25±2)℃，光照强度2000 lx，琼脂7‰，香蕉泥100 g/L，蔗糖25 g/L，pH 5.8.

1.2.5组培苗驯化盆栽试验，清水洗去组培苗芽丛基部培养基，栽植于河沙、腐叶土及河沙∶腐叶土1∶1的基质中，设根系全入土和根系部分入土两种埋根方式，共6个处理，驯化栽培30 d，统计成活率,观察组培苗生长情况，空气湿度保持在70%以上，温度20～25 ℃(表4).

1.3测定指标与方法

每个处理接种30瓶，每瓶接种5个外植体.污染率、诱导率、芽增殖系数、生根率、愈伤率计算公式如下.

污染率(%)=未污染瓶数/30(接种瓶数)

诱导率(%)=诱导出芽苗数/未污染的接种数

芽增殖系数(%)=统计时芽苗数/150(接种外植体数)

生根率(%)=生根株数/150(接种外植体数)

愈伤率(%)=形成愈伤数/150(接种外植体数)

1.4数据处理

应用SPSS 19.0软件进行数据统计分析.

2结果与分析

2.1不同消毒方法对外植体存活率的影响

研究发现，铁皮石斛茎段外植体对消毒剂非常敏感(表1).在3个处理中，70%的乙醇30 s +1‰升汞15 min消毒，污染率明显下降，但是诱导率也相应降低.该处理20%茎段变白，死亡，诱导的不定芽后期生长缓慢，叶绿素降低.而70%的乙醇30 s +1‰升汞80 min处理，污染率高达77%，但诱导率高，死亡率低.70%的乙醇30 s +1‰升汞10 min效果最好，污染率43%，诱导率为97%，诱导的不定芽生长健壮，叶色由起初的黄绿色变为绿色.

表1　不同消毒方法对外植体存活率的影响(30 d)

2.2不同培养基对于成苗效应的影响

2.2.1不同植物生长调节剂组合对成苗的影响取无菌苗为材料，以带节的茎段为外植体诱导成苗，接种45 d统计成苗情况.结果表明，茎段接种后10 d左右有不定芽萌动，一般在茎节形成不定芽，而17 d左右形成不定根.但不同植物生长调节剂组合对不定芽诱导、增殖及生根效应不同.试验表明(表2)，生长素NAA为0.5 mg/L，细胞分裂素6-BA在1.5～3 mg/L区间，芽及根的诱导率及生长随着6-BA质量浓度增加明显改善，尤其是苗高、茎粗、根长及根数达到极显著水平；但当6-BA质量浓度增加到4.5 mg/L时，对铁皮石斛不定芽诱导及生长有明显的抑制作用，而对根的生长没有明显影响.6-BA为3 mg/L，NAA在0.3～0.5 mg/L区间，芽及根的生长随着NAA质量浓度增加明显改善，尤其是不定芽诱导率、苗高、茎粗、根长达到极显著水平;当NAA质量浓度增加到0.7 mg/L时，对铁皮石斛不定芽诱导及生长有明显的抑制作用，而对根的生长具有很好的促进作用，根长及根数达到极显著水平.总体指标统计及观察表明，1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L增殖率明显高于其他处理，苗平均高度及粗度较其他处理高.观察发现此处理获得的培养苗生长健壮，叶色嫩绿，整齐度高.1/2 MS+NAA 0.7 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L，根系明显伸长，1/2 MS+ NAA 0.3 mg/L+6-BA 3mg/L+香蕉泥100 g/L，根系明显伸长，不定芽及不定根生长缓慢，植株细弱.

2.2.2不同基础培养基对成苗的影响以MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L为培养基，组培苗生长正常，颜色嫩绿，但是苗高、茎粗、平均根数和根长都显著低于1/2 MS+ NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+香蕉泥100 g/L培养基，不定芽不定根生长缓慢，增殖率降低，不定根诱导时间较长.

表2　不同植物生长调节剂组合对成苗的影响(45 d)

同列肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.05).

表3　不同基础培养基对成苗的影响(45 d)

同列肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

2.3栽培基质对组培苗成活率的影响

由表4可知，铁皮石斛组培苗栽植根系全部入土成活率明显低于根系部分入土的情况，而以通气性较好的腐叶土和腐叶土∶河沙(1∶1)两种栽培基质为佳，组培苗移栽成活率均达100%.

3讨论

有关铁皮石斛组织培养的研究报道较多[6-9]，涉及外植体选择、培养基筛选、驯化栽培技术等.但现存组织培养技术工艺流程繁杂[5,10-12],铁皮石斛以茎段为外植体组织培养程序一般包括不定芽诱导、增殖、生根和移栽驯化，培养时间长，仅在瓶中就需要120 d左右，诱导后增殖与生根也需要80 d左右.程序繁杂，耗费人力物力，增加了组培苗的成本[13-15].本试验是在前人研究的基础上对铁皮石斛快繁技术进行了优化，合并不定芽诱导、增殖、生根培养3部操作为一步，仅需要50 d，优化了铁皮石斛的快繁程序，获得组织培养苗健壮，可用于大规模生产.

表4　不同栽培基质对组培苗的影响(30 d)

参考文献

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Direct regeneration of seedling from stem fragments of dendrobium candidum

JU Shu-ming1,2,ZHU Wei-ling1,WANG Wei-liang1，GAO Yun2，MA Tao2

(1.Xuzhou Engineering College,Xuzhou 221008,China;2.Engineering Research Centre of Plant for the Fast Propagation Technology,Xuzhou 221008,China)

Abstract：【Objective】 This study aim was to simplify the fast-propagation procedure and short the seedling culture time.【Method】 The stem section of Dendrobium candidum was used as experiment material,the technology on direct regeneration seedlings was studied by fast-propagation.【Result】 The optimum disinfection method was surface sterilization seedlings with 70% ethanol for 30 s,and 1‰ mercuric chloride for 10 min.Optimum seedling cultivation medium was 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 3 mg/L+banana puree 100 g/L+agar 7‰+sugar 25 g/L.Meanwhile,the suitable cycle of subculture in fixed was 50 days.The rooting rate reached 100%,the mean number of roots reached 5.2,and the effective propagation coefficient reached 5.6 after 45 days.Peat and peat river sand (1∶1) were the good transplantion matrix.【Conclusion】 It is suggested that the method shorts the cycle of seedling cultivation,lows the production cost.

Key words：Dendrobium candidum；stem section；tissue culture;direct regeneration seedlings

基金项目：国家星火计划项目(2013GA690441)；徐州科技计划项目(XM13B124).

收稿日期：2014-12-23；修回日期：2015-01-09

中图分类号：S 567.23+9；Q 813.1+3

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)01-0045-04

第一作者：琚淑明(1974-)，女，副教授，博士研究生，主要研究方向为植物生理及分析生物学.E-mail：1239038921@qq.com