绵羊脂肪型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)的变异研究

徐蕾，闫伟，胡江，刘秀，李少斌，王继卿，罗玉柱

(甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃省牛羊基因

改良工程实验室，甘肃 兰州　730070)



绵羊脂肪型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)的变异研究

徐蕾，闫伟，胡江，刘秀，李少斌，王继卿，罗玉柱

(甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃省牛羊基因

改良工程实验室，甘肃 兰州730070)

摘要：【目的】 明确绵羊A-FABP(adipocyte fatty-acid binding protein，A-FABP)基因的变异和单倍型特征.【方法】 基于Ensemble数据库中绵羊A-FABP基因全序列，对7个绵羊品种共20个样本的A-FABP基因全序列进行测序分析.【结果】 PCR扩增获得绵羊A-FABP基因全长6474 bp,A、T、G、C 4种碱基的比例分别为31.48%、33.02%、17.21%和18.29%,A+T平均含量为64.50%，G+C平均含量为35.50%；共发现48处单碱基变异位点和2处微卫星位点M1((TG)n)和M2((TA)n)，单一变异位点、2核苷酸变异位点和3核苷酸变异位点比例分别为28.85%、40.4%和0.02%；共发现转换、颠换、插入和缺失4种变异类型，其占变异位点总数的比例分别为45.83%、31.25%、2.08%及20.83%；共发现19种单倍型，单倍型多样度为0.995.【结论】 A-FABP基因19个单倍型序列的NJ树分化为2个聚类簇，表明A-FABP基因单倍型最初由2个主要单倍型衍化形成.

关键词：绵羊；A-FABP基因；变异

脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein，A-FABP)属于脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein family，FABPs)家族.FABPs家族包括至少9种蛋白，该家族蛋白在细胞脂肪酸代谢及转运中发挥重要作用[1].在哺乳动物中,A-FABP蛋白主要在脂肪细胞中表达[2-3]，参与甘油三酯形成，调控脂肪沉积[4].

人A-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，A-FABP基因变异与人糖尿病、心血管动脉粥样硬化等疾病相关[5-7].A-FABP基因是影响家畜脂肪沉积的主要候选基因之一，家畜A-FABP基因变异会影响相关经济性状.研究表明，牛A-FABP基因参与脂肪蓄积过程[8]，A-FABP基因变异影响大理石纹、肌内脂肪含量和脂肪酸组成[9-12].鸡A-FABP基因第一外显子C>T突变影响生长性状[13]，第三外显子A>G突变影响脂肪酸连接亲和性及脂肪沉积[14].猪A-FABP基因与数量性状位点(QTL)FAT1连锁，A-FABP基因变异影响脂肪沉积[15].Yan等[16]发现绵羊A-FABP基因变异丰富，共发现14种潜在单倍型.Smith等[17]研究表明，绵羊A-FABP基因变异与羊绒抵抗腐烂能力有关.

目前，绵羊A-FABP基因变异研究仅限于单个绵羊品种的部分基因区域，而针对中国多个绵羊品种的A-FABP全基因变异筛查研究少有报道.本研究选择中国7个绵羊品种的20只个体，利用PCR和测序技术对A-FABP基因全序列进行变异分析，为绵羊A-FABP基因进化研究和开发绵羊A-FABP基因分子标记提供理论依据.

1材料与方法

1.1绵羊血样来源及采集

本研究选取7个绵羊品种的20个样本，样本来源和数量分别为‘中国美利奴羊’4只(CM)，‘多浪羊’2只(DL)，‘塔什库尔干羊’3只(TS)，‘藏绵羊’2只(TB)，‘甘肃高山细毛羊’4只(GA)，‘哈萨克羊’3只(KA)和‘青海细毛羊’2只(QF).绵羊颈静脉采血，血样滴到FTA卡上干燥保存.

1.2绵羊基因组DNA提取，全序列扩增、纯化及序列测定

绵羊血样基因组DNA提取采用NaOH两步法[18].根据Ensemble数据库中公布的绵羊A-FABP基因序列(序列号：NM-001114667)，应用Primer5.0软件在线设计5对引物扩增覆盖A-FABP基因全序列,引物序列见表1.引物由宝生物(大连)工程有限公司合成.

PCR采用50 μL的反应体系，DNA模板源自FTA卡(1个1.2 mm的小圆盘)，上下游引物各1.5 μL，5×Prime STAR GXL Buffer 10 μL(大连，宝生物)，dNTP Mixture 4 μL(大连，宝生物)，PrimeSTAR GXL DNA酶1 μL(大连，宝生物)，ddH2O 29 μL.PCR反应条件为：98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸1.5 min，共30个循环，PCR产物4 ℃保存.1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物.PCR产物采用胶回收试剂盒纯化回收(大连，宝生物)，纯化产物送往北京六合华大基因公司测序.

表1　引物序列

1.3数据分析

人工拼接PCR扩增片段组成绵羊A-FABP基因全序列，以Ensemble数据库中公布的绵羊A-FABP基因序列为参考序列，应用DNAMAN软件进行序列比对，分析变异位点位置、数目和类型.应用DnaSP v.5.10软件评估A-FABP基因核苷酸和单倍型多样性，计算多态位点、核苷酸总变异位点及简约信息位点.应用分子进化遗传分析软件MEGA5.0中的NJ算法构建绵羊A-FABP基因全序列的分子进化树.

2结果与分析

2.1绵羊A-FABP基因扩增序列长度和碱基组成

中国7个绵羊品种的20只个体的A-FABP基因扩增序列长度为6474bp，碱基 A、T、G、C含量分别为31.48%、33.02%、17.21%和18.29%，A+T平均含量为64.50%，G+C平均含量为35.50%，说明中国绵羊A-FABP基因全序列富含A和T碱基.

2.2绵羊A-FABP基因变异位点

研究结果表明A-FABP基因所有变异均存在于非编码区和上下游侧翼区域，而编码区没有发现变异位点.研究共发现48处单碱基变异位点(表2)，变异位点总数约占扩增序列碱基数的0.74%.变异位点中单一多态位点15处，约占变异位点总数的31.25%.简约多态位点22处，约占变异位点总数的45.83%，其中两碱基变异位点21处，三碱基变异位点1处.插入/缺失位点11处，约占变异位点总数的22.92%.单一变异位点分布在591、598、599、1572、1591、1854、2180、2765、2810、2816、2919、3193、4773、5431和5469位点.两碱基变异位点分布在336、1103、1774、1776、1806、1912、1913、1983、2119、2918、2921、3081、3212、3393、3425、3952、3961、4305、4905、4963和5687位点，三碱基变异位点分布在1376位点.插入/缺失位点分布在324、325、1377、1441、2767、2789、2827、3949、4257、5414和5426位点.微卫星位点M1和M2的重复单元为简单的二核苷酸重复，其结构分别为 (TG)n和 (TA)n(表2).

2.3绵羊A-FABP基因变异类型和单倍型

A-FABP基因变异存在转换、颠换、插入和缺失4种变异类型，其分别占变异位点总数的45.83%、31.25%、2.08%及20.83%.研究测定绵羊A-FABP基因20条序列，共鉴定19种单倍型(图1)，单倍型序列间多样度为0.995，核苷酸多样度为0.125%，单倍型序列平均核苷酸差异数为8.042.19种单倍型在绵羊群体中的分布见图1，其中‘中国美利奴羊’群体存在4种单倍型(H1、H2、H3和H4)，‘多浪羊’群体存在2种单倍型(H5和H6)，‘塔什库尔干羊’群体存在3种单倍型(H7、H8和H9)，‘藏绵羊’群体存在2种单倍型(H10、H11)，‘甘肃高山细毛羊’群体存在4种单倍型(H12、H13、H14和H15)，‘哈萨克羊’群体存在2种单倍型和H17)，‘青海细毛羊’群体存在2种单倍型(H18和H19).

图1　绵羊A-FABP基因19个单倍型序列的NJ树Fig.1　NJ tree constructed by 19 haplotypic sequences of ovine A-FABP gene

2.4绵羊A-FABP基因全序列分子系统树

构建绵羊A-FABP基因19条单倍型序列的分子系统树(图1)，结果表明系统树分化为2个大的聚类簇(A和B).A类包括11条序列，18个多态位点，核苷酸多样度为0.850%，单倍型序列平均核苷酸差异数为5.491；B类包括8条序列，25个多态位点，核苷酸多样度为0.140%，各单倍型序列平均核苷酸差异数为9.071.A类包括‘多浪羊’‘塔什库尔干羊’‘藏绵羊’‘甘肃高山细毛羊’‘哈萨克羊’和‘青海细毛羊’6个群体；B类包括‘甘肃高山细毛羊’‘中国美利奴羊’‘塔什库尔干羊’和‘哈萨克羊’5个群体.构建绵羊A-FABP基因与其他物种A-FABP基因的系统进化树(序列号分别为：牛NM_174314；猪EF061482.1；人HGNC:3559；狗E2R974；猫HGNC:3559；鸡NP_989621)(图2)，结果表明邻接系统树呈现明显的两支分化.绵羊A-FABP基因与牛A-FABP基因聚在一起，说明牛A-FABP基因序列与绵羊A-FABP基因序列具有很高的同源性.

图2　绵羊他其它物种A-FABP基因序列的NJ树Fig.2　NJ tree constructed by the sequence of A-FABP gene from sheep and other species

3讨论

3.1绵羊A-FABP基因核苷酸

目前为止，绵羊A-FABP基因变异研究国内外均有报道，例如Yan等[16]对新西兰8个绵羊品种的A-FABP基因局部区域进行研究，共发现9条变异序列和8处变异位点.Xu等[19]研究发现中国3个地方品种绵羊A-FABP基因内含子1存在A>G突变.Smith等[17]发现澳州美利奴羊A-FABP基因变异与羊毛性状质量有关.本研究初步对中国部分绵羊品种A-FABP基因全序列进行变异筛查，发现所有变异均存在于内含子区域及上下游侧翼区域.Yan等[16]发现新西兰8个绵羊品种中A-FABP基因第3外显子均存在A>G变异，该变异导致106位氨基酸改变(Lys(AAG)>Arg(AGG))，而本研究中国绵羊品种中均未检测出此变异，该变异是否存在于中国绵羊群体中还需增加样本及绵羊品种数量进一步验证.

本研究发现绵羊A-FABP基因变异存在转换、颠换、缺失和插入4种类型，转换和颠换比例分别为45.83%和31.25%，转换频率高于颠换频率，这一结果与线粒体基因组DNA进化特点一致.哺乳动物线粒体基因组DNA转换的频率通常高于颠换频率，因为CpG二核苷酸上的甲基化胞嘧啶残基最易发生突变，可自发脱去氨基而形成胸腺嘧啶.

中国绵羊群体A-FABP基因变异较丰富，共发现48处变异位点，这一结果与猪A-FABP基因研究结果一致.Ojeda等[20]对10个猪种的23个个体进行A-FABP基因全序列测序，共鉴定出134个变异位点，说明猪A-FABP基因变异极丰富，其变异率远远大于绵羊等其他家畜，而深入研究A-FABP基因变异如何产生将会利于解释家畜A-FABP基因高变异率的原因.

3.2绵羊A-FABP基因系统发育与同源性

研究对7个绵羊品种共20个样本的A-FABP基因全序列进行测序，共鉴定19种单倍型.各绵羊品种间没有共享单倍型，且品种内单倍型较丰富.各单倍型为各绵羊品种独有，且频数只出现1次，但单倍型H11在‘藏绵羊’群体2个个体中同时出现，这说明单倍型H11可能为‘藏绵羊’A-FABP基因优势单倍型，但需进一步验证.绵羊A-FABP基因19个单倍型系统发育分析中，树型呈明显的两支分化，这表明中国绵羊A-FABP基因最初可能是由2个主要单倍型突变分化成两大类单倍型群.系统发育结果还表明绵羊A-FABP基因与牛A-FABP基因具有较高的同源性，说明绵羊和牛A-FABP基因最早可能来自于它们分歧以前的共同祖先的原始序列.研究发现单倍型H10与绵羊参考序列同源，且单倍型H10为藏绵羊独有，这说明藏绵羊A-FABP基因序列和已知绵羊A-FABP基因参考序列具有较高的同源性.

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(责任编辑胡文忠)

Variations on ovine adipocyte fatty-acid binding protein (A-FABP) gene

XU Lei,YAN Wei,HU Jiang,LIU Xiu,LI Shao-bin,WANG Ji-qing,LUO Yu-zhu

(College of Animal Science and Technology,Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology, Gansu Engineering Laboratory of Genetic Improvement in Runminants,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 The paper is aimed at revealing genetic variation and the characteristics of haplotype in sheep.【Method】 Based on the complete sequence of ovine A-FABP gene in Ensemble database,the A-FABP gene was sequenced and analyzed in 20 samples collected from 7 breeds.【Result】 The sequence (6 474 bp) of the A-FABP gene was obtained by the PCR process.The average percent of four bases (A,T,G and C) was 31.48%,33.02%,17.21% and 18.29%,respectively,the average content of A+T and G+C is 64.50% and 35.50% ,respectively.Forty eight variation sites and two microsatellite loci for M1((TG)n)and M2((TA)n)were found,the percentage of single variation site,two variation sites and three variation sites was 28.85%,40.4% and 0.02%,respectively.4 variation types (transition,transversion,insertion and deletion) were observed,and their ratio was 45.83%,31.25%,2.08% and 20.83%,respectively.19 haplotypes were found and the haplotype diversity was 0.995.【Conclusion】 The NJ tree constructed by nineteen haplotypes developed two main clusters,which indicated that 19 haplotypes initially derived from two main haplotypes.

Key words：sheep；A-FABP gene；variation

通信作者：罗玉柱，男，教授，博导，研究方向为生物技术与动物育种.E-mail:luoyz@gsau.edu.cn

基金项目：甘肃农业大学盛彤笙科技创新基金(GSAU-STS-1421)；甘肃省创新研究群体计划(1210RJIA005)；国家科技支撑计划(2012BAD13B05)；国家国际科技合作专项(2011DFG33310)； 甘肃省国际科技合作专项(1304WCGA178 ).

收稿日期：2015-03-04；修回日期：2015-04-03

中图分类号：S 826

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)01-0029-06

第一作者：徐蕾(1987-)，女，硕士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖.E-mail:18893704730@163.com