脑红蛋白在成年牦牛小肠肠腺中的定量分析

陈斌，刘霞，曹亮，刘应祥，杨阳，杜晓华

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州　730070；2.酒泉职业技术学院，甘肃 酒泉　735000；

3.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州　730070)



脑红蛋白在成年牦牛小肠肠腺中的定量分析

陈斌1，刘霞1，曹亮2，刘应祥1，杨阳3，杜晓华3

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州730070；2.酒泉职业技术学院，甘肃 酒泉735000；

3.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州730070)

摘要：【目的】检测脑红蛋白(neuroglobin，NGB)在成年牦牛小肠肠腺中的表达量.【方法】 在免疫组织化学SP法染色基础上，运用IPP图像分析软件测定牦牛小肠肠腺中染色区域的平均积分光密度值，再结合SPSS统计软件对测定结果进行相关统计学分析.【结果】 NGB在成年牦牛小肠肠腺中均有表达.在十二指肠肠腺、十二指肠腺(黏膜下腺)中测定的MIOD值分别为0.004 6、0.040 9，在空肠肠腺中测定的MIOD值为0.001 8，在回肠肠腺中测定的MIOD值为0.001 6.十二指肠表达量最多，空肠、回肠顺次递减；十二指肠腺(黏膜下腺)显著(0.01

关键词：脑红蛋白；牦牛；肠腺；平均积分光密度

2000年，德国科学家Burmester等[1]在《Nature》上首次报道，在人和小鼠脑内存在一类新的携氧球蛋白，对氧具有很高的亲和力，由于该蛋白最先在大脑内发现，故称之为脑红蛋白(neuroglobin，NGB).此后，科学家们陆续发现 NGB存在于哺乳动物、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类等动物体内[2-4]，并对其结构、分布及功能等方面进行了研究.2013年，曹亮等[5]在成年牦牛消化系统的内分泌细胞中首次发现了NGB阳性物质的表达，为NGB在哺乳动物消化系统中生理生化功能的研究提供了新的思路与途径.小肠是哺乳动物消化道内营养物质消化和吸收的主要器官，其内分布的肠腺具有分泌肠液的能力，大量的肠液可以稀释消化营养物质，使其渗透压下降，有利于营养吸收[6].常用的适用于医学和生物学领域的图像分析软件有ImageJ、IPP、CMIAS图像分析系统及CIAS-1000等多种软件，其中IPP软件以其强大的测定分析功能被广泛应用于医学、工业、军事等领域[7-8].本研究在曹亮等[5]的研究基础上采用免疫组化SP法和平均积分光密度分析法(mean integrated optical density，MIOD)对NGB在成年牦牛小肠肠腺中的分布进行了定量研究，研究结果为掌握NGB在成年牦牛消化腺细胞中的分布特点及进一步探讨NGB的生理生化功能提供了详细的形态学资料，也为牦牛高原低氧环境的适应性机理研究提供相关的数据参考.

1 材料与方法

1.1试验动物

成年牦牛小肠组织样本来自于甘肃农业大学解剖学实验室，采集自甘肃省甘南自治州，多聚甲醛固定保存.

1.2组织切片制作流程

首先制作小肠各段组织石蜡切片，然后进行免疫组化SP法染色[9-10]，同时设立HE染色组和阴性对照组.组织切片制作主要包括固定、包埋、切片、染色等步骤，镜检合格后拍照并对图片进行相关测定与分析.

1.3图像测定

IPP图像分析软件的众多参数中，积分光密度(integrated optical density，IOD)是指测定的显微图像结构范围内各个像素点的光密度之和，可反映所测结构的光密度与面积的综合变化.IOD与特定物质的质量成正比，数值反映了特定物质的相对含量[11].在计算特定组织区域光密度值时需先测定该特定区域的面积，然后再做除法，得出更为准确的MIOD(MIOD=IOD/面积值).

运用NIKON ECLIPSE 80i显微摄像系统对染色切片进行拍照，IPP图像分析软件进行数据测定，具体步骤如下：1)测定特定区域面积：随机选取需要测定的区域，转换为Object后测定该区域的面积；2)测定特定区域IOD：在原选定的区域上进行光密度值校正，选择测定项目，设置分色选择参数，计算出IOD值.将测定出的两个数值导入Excel 2010软件计算出各染色区域的MIOD值，阴性对照的MIOD值测定方式同上，其测定结果均为0.

1.4数据处理

2结果与分析

牦牛小肠各肠段组织切片见图1-4.经显微镜镜检确认，牦牛小肠中肠腺均为管状腺，分为两种，一种位于十二指肠、空肠、回肠固有层中的肠腺，另一种位于十二指肠黏膜下层中的十二指肠腺，属于黏膜下腺[12].运用IPP软件对各肠段免疫组化SP法染色图片进行NGB定量检测，结果如表1所示，以十二指肠腺(黏膜下腺)表达量最高，回肠肠腺表达量最低.在十二指肠腺(黏膜下腺)中测定的MIOD值为(0.040 9±0.010 141)；在十二指肠肠腺中测定的MIOD值为(0.004 6±0.000 305)；在空肠肠腺中测定的MIOD值为(0.001 8±0.000 487)；在回肠肠腺中测定的MIOD值为(0.001 6±0.000 403).

a：免疫组化染色；b：阴性对照；c：HE染色；标尺示20 μm.图1　NGB在成年牦牛十二指肠肠腺中的表达Fig.1　The expression of NGB in duodenal intestinal glands in adult yak

a：免疫组化染色；b：阴性对照；c：HE染色；标尺示20 μm.图2　NGB在成年牦牛十二指肠腺中的表达Fig.2　The expression of NGB in duodenal glands in adult yak

a：免疫组化染色；b：阴性对照；c：HE染色；标尺示20 μm.图3　NGB在成年牦牛空肠肠腺中的表达Fig.3　The expression of NGB in jejunum intestinal glands in adult yak

a：免疫组化染色；b：阴性对照；c：HE染色；标尺示20 μm.图4　NGB在成年牦牛回肠肠腺中的表达Fig.4　The expression of NGB in ileum intestinal glands in adult yak

肠段十二指肠肠腺空肠肠腺回肠肠腺十二指肠腺(黏膜下腺)10.00460.00150.00190.044920.00430.00140.00200.052430.00490.00260.00190.045640.00500.00210.00120.026550.00440.00180.00120.0351Mean±SD0.0046±0.0003050.0018±0.0004870.0016±0.0004030.0409±0.010141

经SPSS 18.0统计软件对测定结果进行t检验分析，结果如图5所示.NGB在十二指肠腺(黏膜下腺)中的表达量极显著高于阴性对照(P<0.01)，认定NGB在十二指肠腺(黏膜下腺)中有阳性表达；NGB在十二指肠肠腺、空肠肠腺、回肠肠腺中的表达量都显著地高于阴性对照(P<0.05)，认定NGB在十二指肠肠腺、空肠肠腺、回肠肠腺中均有阳性表达.

*:阳性与阴性对照组比较差异显著(P<0.05)；**:阳性与阴性对照组比较差异极显著(P<0.01).图5　NGB在成年牦牛不同肠腺中的表达Fig.5　The expression of NGB in different intestinal glands in adult yak

NGB在成年牦牛不同肠段的肠腺中表达量的比较如图6所示.在不同肠段内，NGB在同种腺体中的表达量不同，十二指肠肠腺的MIOD值为0.004 6，空肠肠腺的MIOD值为0.001 8，回肠肠腺的MIOD值为0.001 6.经SPSS统计软件对测定数值进行单因素方差分析和多重比较，结果表明，NGB在十二指肠的表达量显著高于其在回肠和空肠的表达量(P<0.05)，空肠又高于回肠，但差异不显著(P>0.05).在十二指肠内，十二指肠腺(黏膜下腺)的MIOD值为0.040 9，十二指肠肠腺的MIOD值为0.004 6，经SPSS统计软件对测定数值进行独立样本t检验，NGB在十二指肠腺(黏膜下腺)表达量显著高于其在十二指肠肠腺表达量(P<0.05).

标有相同字母表示无显著差异，标有不同字母表示差异显著(P<0.05).图6　NGB在成年牦牛不同肠段的肠腺中表达量的比较Fig.6　Expressive quantity of NGB in different intestinal glands in adult yak

3讨论与结论

NGB的发现为了解机体氧代谢机制提供了新的线索和依据，已成为国内外学者研究的热点.Reuss等[13]利用原位杂交方法在啮齿类动物内分泌系统的某些组织细胞中检测到了NGB的表达.秦豪杰等[14]研究发现NGB在人腺垂体、胰岛、肾上腺等一些内分泌细胞中有阳性表达，说明NGB对内分泌细胞功能的维持有一定作用.本研究显示，NGB在成年牦牛十二指肠肠腺、空肠、回肠肠腺以及十二指肠腺(黏膜下腺)的内分泌细胞内均有阳性表达，而在其他细胞中未发现，这一分布特点与曹亮等[5]的研究结果基本一致，说明NGB在内分泌组织生理功能的正常发挥中也起着重要的作用.

付成英等[15]研究发现在人胎儿小肠固有层结缔组织中有散在的内分泌细胞，其分布数量以十二指肠最多，空肠、回肠顺次递减.本研究发现，牦牛不同肠段内NGB的表达量亦不同，其在十二指肠肠腺的表达量显著高于其在空肠和回肠的表达量，这说明NGB在不同内分泌细胞中的表达情况具有特异性，提示这与十二指肠、空肠、回肠的消化能力逐渐减弱，需氧量逐渐变少有关.

同时发现，NGB在牦牛同一肠段内不同腺体中的表达量不同，在十二指肠腺(黏膜下腺)的表达量显著高于其在十二指肠肠腺的表达量，提示这可能与内分泌细胞在小肠的腺体中分布不均以及与NGB的生理生化功能相关，甚至可能与十二指肠腺(黏膜下腺)作为一种重要的分泌腺在动物机体内发挥的功能强于十二指肠肠腺有联系，但是这种联系是否与牦牛对高原低氧环境适应性有关还需要进一步证实.综上所述，NGB在哺乳动物消化组织、器官中的首次发现为NGB在消化器官生理生化功能的研究提供了新的思路[16].

NGB自发现即成为了研究热点，很多学者在其分布和功能等方面进行了较深入的研究[17-18]，但是现有的文献中对于NGB在人和动物体内的分布表达与其生理作用机制联系起来的报道极为少见.因此有关NGB作用机制的研究将会是未来相关研究的方向和重点.

参考文献

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(责任编辑赵晓倩)

Quantitative analysis of neuroglobinin intestinal glands in adult yak

CHEN Bin1,LIU Xia1,CAO Liang2,LIU Ying-xiang1,YANG Yang3,DU Xiao-hua3

(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Jiuquan Vocational and Technical College,Jiuquan 735000,China；3.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 The objective of this study is to detect the expressive quantity of neuroglobin (NGB) in intestinal glands of adult yak.【Method】 Based on SP method of immunohistochemistry dyeing,the mean integral optical density of yak intestinal glands，staining region was determined by IPP image analysis software,the data were analyzed with SPSS statistical software.【Result】 NGB was expressed in all intestinal glands of adult yak.Values of MIOD detected in intestinal glands of duodenum and duodenal gland were 0.004 6 and 0.040 9.Values of MIOD detected in the intestinal glands of jejunum andileum were 0.001 8 and 0.001 6.The expressive quantity of NGB in duodenal glands was the most and ileum was the least.The most expression was in duodenum,jejunum was at a median value,ileum was the least.Expression in duodenal gland was significantly higher than in intestinal glands of duodenum.【Conclusion】 The NGB was distributed in all intestinal glands of adult yak,duodenal gland obtaining the most abundant.It suggested that NGB in tissues and cells of adult yaks，intestinal glands plays an important role in oxygen utilization and functional activities.

Key words：neuroglobin;yak ;the small intestine;mean integrated optical density

通信作者：杜晓华，男，副教授，博士，硕士生导师，主要从事动物解剖学与组织学研究.E-mail:duxh@gsau.edu.cn

基金项目：甘肃省高等学校基本科研业务费资助项目(2013)；甘肃农业大学本科生SRTP重点项目(20140811).

收稿日期：2015-03-06；修回日期：2015-04-20

中图分类号：S 852.16

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)01-0024-05

第一作者：陈斌(1993-)，男，本科生，研究方向为动物解剖学与组织学.E-mail:501200399@qq.com