临床高危因素及凝血酶原基因G20210A突变和FVL突变对肺栓塞的诊断预测价值

褚国芳　赵凤芹　石少敏

(吉林大学中日联谊医院呼吸内科，吉林　长春　130033)



临床高危因素及凝血酶原基因G20210A突变和FVL突变对肺栓塞的诊断预测价值

褚国芳赵凤芹石少敏

(吉林大学中日联谊医院呼吸内科，吉林长春130033)

〔摘要〕目的研究肺栓塞(PE)的临床高危因素，探讨凝血酶原基因G20210A突变和凝血因子Ⅴ Leiden(FVL)突变对中国东北地区人群肺血栓栓塞(PTE)的预测价值。方法回顾性分析126例确诊PE患者的临床高危因素资料。通过排除标准选取96例PTE患者作为实验组，选取同期来自相同地区，性别和年龄相匹配的健康人96例作为对照组，采取聚合酶链式反应(PCR)和Hind Ⅲ限制性内切酶片段多肽性分析(RFLP)，检测两组凝血因子V基因和凝血酶原G20210A基因的突变。结果126例患者均存在临床高危因素，其中深静脉血栓形成(DVT)90例(71.4%)，慢性心肺疾病者41例(32.5%)，手术史30例(23.8%)，肿瘤病史25例(19.8%)，外伤史者21例(16.7%)，长期卧床10例(7.9%)，肥胖9例(7.1%)，DVT溶栓治疗过程中发病8例(6.3%)，系统性红斑狼疮1例(0.8%)，烧伤1例(0.8%)。实验组及对照组凝血酶原基因G20210A和FVL突变频率均为0%，两组比较无统计学意义(P>0.05)。结论PE常见临床高危因素包括DVT、慢性心肺疾病、手术、肿瘤、外伤及肥胖等因素。凝血酶原基因G20210A突变、FVL突变对我国东北地区人群PTE诊断没有预测价值。

〔关键词〕肺栓塞；血栓；遗传；突变

肺栓塞(PE)是一种常见的呼吸科急症，西方国家发现凝血酶原基因G20210A突变及凝血因子V基因Leiden(FVL)突变与静脉血栓栓塞症〔VTE，包括肺血栓栓塞(PTE)和深静脉血栓形成(DVT)〕密切相关。大多数相关研究认为上述两种基因突变存在种族和地区差异〔1〕，且同时增加了VTE的发生率及复发率〔2〕；仅有少数研究表明两项基因突变与VTE复发无明确相关性〔3〕。国内的大多研究认为中国人群不存在这两种基因突变，在东北地区尚缺乏相关性研究。本文拟分析其与中国东北地区人群PTE的相关性。

1对象与方法

1.1对象选择2013年10月至2015年10月在吉林大学中日联谊医院临床确诊PE住院患者126例，其中男68例，女58例，年龄21~83岁，平均(53.78±12.38)岁。经螺旋CT肺动脉造影(CTPA) 和(或)核素肺灌注显像发现充盈缺损，并结合临床症状确诊，诊断标准参照中华医学会呼吸病分会“肺血栓栓塞症诊断与治疗指南(草案)”〔4〕。实验组：患者126例临床确诊PE患者，其中符合条件的PTE96例，男52例，女44例，年龄21~80岁，平均(54.82±11.27)岁。排除标准：①分娩中及分娩后出现PE；②长骨骨折、严重脂肪组织挫伤或脂肪挤压伤患者合并PE；③肿瘤患者合并PE。

对照组：选择同期吉林大学中日联谊医院健康志愿者或体检正常者96例，男52例，女44例，年龄20~82岁，平均(53.96±12.36)岁。均与PTE患者来自相同地区，年龄、性别相似，无PTE病史及家族史，无风湿、内分泌、肾、肺等系统疾病史，无肿瘤病史，无近期妊娠、分娩及外伤者。所有研究对象均在东北地区居住5年及以上。两组性别构成及年龄无统计学差异。对所有研究对象遵循医学伦理学一般原则，均知情同意。

1.2方法

1.2.1观察指标回顾性分析患者的年龄、性别、体重及既往有无DVT、心肺疾病、肿瘤、外伤、手术、制动及长期卧床等。

1.2.2实验方法

1.2.2.1PCR 及Hind Ⅲ限制性酶切实验抽取研究对象静脉血2 ml，用试剂盒提取其DNA后保存。分别用以下引物：Prothrombin 基因：FⅡ20210-1：5′-GCA CAG ACG GCT GTT CTC T T-3′，FⅡ20210-2：5′-ATA GCA CTG GGA GCA TTG AAG C-3′；Factor V基因：FV-1：5′-TCA GGC AGG AAC AACACC AT-3′，FV-2：5′-GGT TAC TTC AAG GAC AAA ATA CCT GTA AAG CT-3′〔5〕，在PCR扩增仪中经35个循环扩增凝血酶原基因和凝血因子Ⅴ基因相关片段，将扩增产物电泳，再通过凝胶成像仪系统分析。然后通过Hind Ⅲ对扩增成功的基因PCR产物，进行酶切实验，对产物10 μl进行电泳，用凝胶成像仪分析。

1.2.2.2酶切结果判断酶切可得到3种基因型：(1)Prothrombin 基因：Homozygotes(纯合型A/A)384 bp，99 bp，23 bp；Heterzygotes(杂合型G/A)：407 bp，384 bp，99 bp，23 bp；Wild type(野生型G/G)：407 bp，99 bp。(2)Factor V基因：Homozygotes(纯合型Q/Q)：209 bp，32 bp；Heterzygotes(杂合型R/Q)：241 bp，209 bp，32 bp；Wild type(野生型R/R)：241 bp。

1.3统计学方法采用SPSS21.0软件进行χ2检验或t检验。

2结果

126例患者均存在临床高危因素，其中合并DVT 90例(71.4%)，慢性心肺疾病41例(32.5%)，手术史30例〔23.8%，其中关节置换术3例(2.4% )〕，肿瘤病史者25例〔19.8%，其中肺癌4例(3.2%)〕，外伤史者21例〔16.7%，其中车祸史3例(2.38%)〕，长期卧床10例(7.9%)，肥胖9例(7.1%)。DVT溶栓治疗过程中发病8例(6.3%)，系统性红斑狼疮1例(0.8%)，烧伤1例(0.8%)。存在1个危险因素的47例(37.3%)，2个危险因素45例(35.7%)，3个高危因素27例(21.4%)，4个或4个以上高危因素7例(5.6%)。

PCR扩增结果：Prothrombin 基因：506 bp(图1)，Factor V 基因：241 bp(图2)。所有Prothrombin 基因PCR扩增的DNA片段，经酶切后均出现大小为407 bp和99 bp的DNA条带(图3)。所有Factor V 基因PCR扩增的DNA片段，经酶切后均仅出现1条大小为241 bp的DNA条带(图4)。表明Prothrombin 基因扩增序列只有1个酶切位点，两组基因都不存在因基因突变导致的Hind Ⅲ酶切位点，所有样本均是野生型基因。

1~12 PTE患者；13~21对照组图1　Prothrombin G20210基因 PCR扩增产物

1~12 PTE患者；13~23对照组图2　Factor V基因PCR扩增产物

1~12 PTE患者；13~24对照组图3　Prothrombin G20210基因 PCR扩增产物 HindⅢ酶切电泳图

1~12 PTE患者；13~22对照组图4　Factor V基因 PCR扩增产物 Hind Ⅲ酶切电泳图

3讨论

1856年Virchow提出菲尔绍血栓三要素：血流停滞、血液高凝状态及血管内皮损伤，各项高危因素都是以上三要素部分或全部参与的结果。乏氧、外伤及手术均可导致血管内皮系统损失，而乏氧、肿瘤、心肺疾病及肥胖会引起血液高凝，卧床、术后制动显而会导致血液瘀滞。心肺疾病及其他原因引起的长期乏氧可导致红细胞增多，血液高凝状态，同时释放NO和血栓素损伤血管内皮。恶性肿瘤细胞及其产物与其宿主之间的相互作用可导致血液高凝，肿瘤细胞表达及释放组织因子(TF)、丝氨酸蛋白酶hepsin和癌促凝物质(CP)三种主要促凝物质〔6〕。肿瘤压迫、浸润血管，肿瘤的手术及放化疗均会导致血管内皮系统损伤、血流缓慢。大部分研究认为PE的临床高危因素为DVT、心肺疾病、创伤手术、恶性肿瘤、口服避孕药、妊娠、肾病综合征及结缔组织疾病等。本文PE的临床高危因素为DVT、慢性心肺疾病、手术、肿瘤、外伤及肥胖等因素，与国内外研究结论基本相符，但无口服避孕药、妊娠及肾病综合征者等，可能与本研究病例数较少有关，可能与我国口服避孕药人群明显低于欧美国家亦相关。另外，许多恶性肿瘤病人在病程中出现血栓性疾病，也有部分病人先出现血栓栓塞，后发现原发肿瘤，两者间的因果关系尚有待于进一步研究。Poort等〔7〕于1996年发现凝血酶原基因mRNA前体3′端未翻译区第20210位核苷酸发生G-A突变，称为凝血酶原G20210A突变，突变后使基因合成增多，或转录的mRNA破坏减少，进而使凝血酶原水平升高，从而导致血液高凝。杂合的G20210A等位基因在静脉血栓者中检出率为7%~18%〔8〕，而携带该基因的杂合子突变可使VTE发生的风险增加2~4倍〔9〕。在非西班牙人和墨西哥裔美国人中该基因突变的检出率为1.1%，而在美国黑人中的检出率为0.3%〔10〕，但在有关中国人的大多数研究中检出率为0%〔11，12〕。

Dahlback等〔13〕于1993年发现活化蛋白C抵抗(APCR)是导致血液高凝的重要遗传因素。其后，Bertina等〔14〕发现FVL突变是活化蛋白C抵抗的原因，该突变是凝血因子Ⅴ基因10号外显子1 691位核苷酸发生G-A突变，改变凝血因子Ⅴa分子上的活化蛋白C(APC)裂解位点，APC无法灭活凝血因子Ⅴa〔15〕，造成凝血因子Ⅴa对APC抗凝血活性产生抵抗，即APCR。FVL突变与种族和地区分布有关，其检出率为2%~13%〔8〕，在欧美白种人中，FVL突变在静脉血栓者中的检出率为12%~30%，携带该突变可使VTE的风险升高7倍〔16〕。该基因突变在西班牙人中不常见，在非洲、亚洲人中极为少见。我国北京、上海、山东、新疆等地亦有关于该基因突变的研究，大多数表明其检出率均为0%。

研究发现凝血酶原基因G20210A突变和FVL突变可存在于正常白种人中，西方国家提出其突变，正如肿瘤的癌基因与抑癌基因一样，其致病也有激发及抑制因素，可能的激发因素有慢性肝病，但在临床高危因素中我们未统计慢性肝病者，以后研究可纳入。我们开展的PTE遗传因素的相关研究，一直未检出这两项基因突变。本次研究适当增加病例数，仍未发现凝血酶原G20210A突变和FVL突变，这两项基因突变可能对我国东北地区人群PTE的诊断没有预测价值。实验结果同国内大多数研究结果一致。然而由于本组研究样本例数较少，且相关研究在国内开展的范围较小，以后还需扩大地区、扩大样本量进一步研究。

4参考文献

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3Lijfering WM，Middeldorp S，Veeger NJ，etal.Risk of recurrent venous thrombosis in homozygous carriers and double heterozygous carriers of factor V Leiden and prothrombin G20210A〔J〕.Circulation，2010；121(15)：1706-12.

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14Bertina RM，Koeleman BP，Koster T，etal.Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C〔J〕.Nature,1994;369(6475)：64-7.

15Huber S，McMaster KJ，Voelkerding KV.Analytical evaluation of primer engineered multiplex polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism for detection of factor V Leiden and prothrombin G20210A〔J〕.J Mol Diagn，2000;2(3)：153-7.

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〔2015-11-10修回〕

(编辑滕欣航)

〔中图分类号〕R563.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1136-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.053

通讯作者：赵凤芹(1964-)，女，主任医师，副教授，博士，硕士生导师，主要从事肺栓塞、肺癌及呼吸系统感染性疾病的研究。

基金项目：吉林省科技厅基础处资助项目(201115092)

·呼吸、消化系统疾病·

第一作者：褚国芳(1988-)，女，在读硕士，主要从事呼吸病学研究。