纳米叶酸磁珠靶向检测技术在老年结直肠癌患者早期诊断中的应用

2016-04-14乔宝军李世荣武子涛李爱琴康倩何玉琦桂红珍盛剑秋

中国老年学杂志 2016年5期

关键词：纳米技术结直肠癌

乔宝军李世荣武子涛李爱琴康倩何玉琦桂红珍盛剑秋

(第三军医大学研究生院，重庆　400038)

纳米叶酸磁珠靶向检测技术在老年结直肠癌患者早期诊断中的应用

乔宝军李世荣武子涛李爱琴康倩何玉琦桂红珍盛剑秋1

(第三军医大学研究生院，重庆400038)

〔摘要〕目的探讨纳米叶酸磁珠靶向检测技术在老年结直肠癌患者早期诊断中的应用。方法经肠镜活检确诊的早期结直肠癌老年患者115例，随机分为两组，即A组-新型清肠液收集装置检测，63例；B组-新型清肠液收集装置结合纳米叶酸磁珠检测，52例。收集患者自然粪便和结肠镜检前的清肠液；转铁蛋白检测法检测粪便中的转铁蛋白；应用常规方法和纳米叶酸磁珠检验粪便脱落细胞筛查早期结直肠癌。结果A、B两组自然粪便中便隐血试验阳性人数均较清肠液低(P均<0.05)；A、B两组自然粪便中通过检验粪便脱落细胞筛查早期结直肠癌的阳性人数较清肠液低(P均<0.05)；使用纳米叶酸磁珠靶向检测技术的阳性率在两组中都比使用传统检测技术高(P均<0.05)。结论纳米叶酸磁珠靶向检测技术在老年结直肠癌患者早期诊断中的应用效果非常显著，可能是对结直肠癌进行早期筛查和诊断的良好方法。

〔关键词〕纳米技术；叶酸受体；结直肠癌；靶向检测

结直肠癌一直是中国人最为常见的恶性肿瘤之一〔1，2〕，高发生率，而且早期的临床表现不显著。叶酸受体(FR)的亚型FRα有抗原性及受体，故可介导细胞内反应的作用，其可用在肿瘤诊断和靶向治疗领域〔3，4〕。由于FRα的表达与结直肠癌的发生、发展有密切关系〔5~7〕，本研究探究纳米技术在FR介导的老年早期结直肠癌患者细胞靶向检测中的应用。

1资料与方法

1.1一般资料2013年5月至2014年12月我院经肠镜活检确诊的早期Ⅰ~Ⅱ期结直肠腺癌的老年患者115例。均经肠镜活检确诊的早期结直肠癌。排除标准：①各型病毒性肝炎的患者；②自身免疫性疾病的患者；③其他恶性肿瘤患者；④糖尿病患者；⑤严重的心血管疾病患者；⑥严重的脑血管疾病患者；⑦肾功能损害患者；⑧严重肺气肿患者；⑨房颤等严重心律失常患者；⑩各种精神疾病患者。失联预计原因：①中途退出试验；②试验过程中转院治疗；应对措施：按照1∶1比例相应补充受试患者。伦理学考量：①患者及其直系家属在充分了解研究的过程的基础之上签署参与该临床研究的知情同意书；②纳入患者相关诊治和监护措施均以临床指南相关原则为依据，对患者的医疗治疗和安全有充分保障。③对纳入患者的信息及诊疗记录予以保密，保护患者的隐私权。④在中国临床试验注册中心注册试验方案，试验中遵循《渥太华工作组关于临床试验注册的声明》。

1.2分组按照计算器随机数字法随机分为两组，即A组63例，男33例，女30例，平均年龄(68.31±8.02)岁。B组52例，男28例，女24例，平均年龄(67.25±6.43)岁。两组年龄、性别比、肿瘤分期和肿瘤分型均无统计学差异(P>0.05)。A组：新型清肠液收集装置收集患者的自然粪便和清肠液后常规检验粪便脱落细胞筛查早期结直肠癌；B组：新型清肠液收集装置收集患者的自然粪便和清肠液后应用纳米叶酸磁珠检验粪便脱落细胞筛查早期结直肠癌。

1.3仪器与试剂免疫粪便隐血试剂盒(消康保)；粪便转铁蛋白检测试剂盒(诉而准)。以上二者均为胶体金法。购自北京万华普蔓生物工程有限公司。BCD826型排便清肠器(江苏立刻通公司)。纳米叶酸磁珠检测试剂盒(北京化工大学提供)。细胞保存液(又叫液基细胞保存液)；北京军区总医院制剂中心生产。5 ml塑料吸管，15 ml、50 ml尖底离心管购自江苏海门仪器厂。离心机购自北京医用离心机厂。自动细胞制片机及其附属设备购自浙江宁波美生医疗器械有限公司。光学显微镜为 Olympus BX-50型。换气消毒工作台购自北京京东医疗仪器有限公司。微量振荡器XK96-4E型由江苏新康医疗器械有限责任公司设计制造。

1.4检测方法(1)便隐血试验(FOBT)〔8〕操作步骤：按照说明逐步进行。(2)新型清肠液收集装置收集患者清肠液：①留患者结肠镜检前排出的第4次清肠液；②装入广口瓶里面；③20℃放置置0.5 h；④弃上清；⑤取30 ml置入收集瓶里面；⑥加入细胞的保存液；⑦充分摇匀；⑧送检(2 h之内)；⑨提取脱落细胞。(3)常规法行粪便脱落细胞筛查早期结直肠癌筛查：操作步骤：①取患者自然粪便和清肠液50~100 ml；②加入100 ml MEM细胞营养液；③搅拌混合；④经孔径600 μm筛网过滤，滤液中加入过饱和量的硼酸以溶解粪便中的黏液，搅拌使硼酸充分溶解；⑤依次经孔径150 μm和76 μm筛网过滤；⑥1 500 r/min，室温离心10 min；⑦弃去上清，5 ml生理盐水进行重悬；⑧重悬液与20 ml 95%乙醇混匀；⑨过滤(筛网孔径50 μm)，1 500 r/min，20℃离心10 min；⑩弃上清，取沉淀涂片，涂片经95%的乙醇固定15 min，HE染色，光镜下观察。(4)应用纳米叶酸磁珠检验粪便脱落细胞筛查早期结直肠癌：①将患者自然粪便和清肠液加细胞保存液至50 ml；②用吸管吹打再次充分混匀；③过滤(筛网孔径600 μm)；④弃滤渣，20℃离心10 min(转速：1 200 r/min)；⑤弃上清，保留沉淀物；⑥加10 ml保存液和40 μl含磁珠的悬液混匀，37℃孵育45 min；⑦将装有混悬液的离心管与磁铁贴壁反应15 min，将上清液移入另一15 ml尖底离心管；⑧用2 ml液基保存液冲洗贴壁磁珠-细胞结合物，吹打，离心10 min，1 000 r/min；⑨磁珠和细胞的悬液1 ml及上清液1 ml置液基的薄层型制片夹，20℃离心4 min，1 000 r/min；⑩细胞涂片，使用95%乙醇进行固定10 min后HE染色。

1.5观察指标①FOBT阳性率；②通过检验粪便脱落细胞筛查早期结直肠癌的检出率。

1.6统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行χ2检验。

2结果

2.1FOBT阳性率A组便隐血试验阳性52例，清肠液阳性59例；B组便隐血试验阳性46例，清肠液阳性50例。A、B两组自然粪便中便隐血试验阳性人数均较清肠液低(P均<0.05)。

2.2通过检验粪便脱落细胞筛查早期结直肠癌的检出率A、B两组自然粪便中通过传统方法检验粪便脱落细胞筛查早期结直肠癌的阳性人数49、49例，较清肠液56、52例低(P均<0.05)；B组较A组检出率明显高(P均<0.05)。见图1。

图1　两组脱落细胞筛查早期结直肠癌的检出比较(×20)

3讨论

叶酸及修饰有叶酸的纳米级磁性材料(FA)亦称碟谷酰胺〔9〕。该维生素的结构是由碟酸与谷氨酸两种物质脱水以后形成的复合体。因为FR主要识别碟酸，故而碟谷酰胺常常通过谷氨酸的羧基端和其他生物材料相连之后再与FR相互结合。FR是一种富含半胱氨酸的糖蛋白，有三种常见的异构体，即包括有FRα和FRβ及FRγ〔10，11〕，其可以通过糖基化的磷脂酰肌醇连接于各种细胞的胞膜表面。FR的亚型中的FRα在正常组织之中的表达水平非常低，然而在肿瘤组织之中的表达则很高。如果采用超出生理剂量的叶酸制剂加入离体培养的肿瘤细胞悬液之中会诱发肿瘤细胞的加速增殖，而且癌组织内FR水平的上调也会导致癌组织的生长加快和叶酸的堆积。这一系列的研究发现为FR应用于肿瘤细胞的靶向检测奠定基础〔12~14〕。较之其他生物材料，碟谷酰胺在生物材料修饰中有其独特的优势。FR碟谷酰胺不但价格低廉且容易获得，其性质尤其稳定，而且储存非常方便。此外，FR在人体多种肿瘤中均高表达，故而适用的肿瘤类型极其广泛。因为碟谷酰胺是人体内必需的维生素〔15，16〕，故而其免疫原性很低。碟谷酰胺无任何毒性，其和FR的亲和力非常高。此外，碟谷酰胺的分子很小而且渗透非常快，故而碟谷酰胺能够通过FR诱导的细胞膜内吞作用进入各种细胞之内，这一特性非常便于碟谷酰胺作为运载物在细胞中被人体摄取。此外，碟谷酰胺还能够和其他生物材料发生定向性耦联并其长时间保持生物活性。

磁性纳米材料直径在1~100 nm〔17，18〕，是一种具有非常独特的磁性效应、量子尺寸效应、小尺寸效应、比表面积效应和宏观量子隧道效应等等特殊效应的纳米级别的粒子，故而具有非常独特的技术优势：①这种材料的尺寸非常小；②该纳米材料能够自由地渗透进入血管内；③该纳米材料在外磁场的作用之下可以产生磁性，继而发生聚集；④该纳米材料可以随着磁场的变化而发生热效应；⑤该纳米材料能够按照不同的使用目的而进行各种人工修饰，以期增加其生物的相容性和诊疗的靶向性。通过碟谷酰胺的α羧基端或者γ羧基端能够与具备氨基的磁性纳米级生物材料形成酰胺键。因为肿瘤组织的血管异常丰富而且其内部结构性很差，故而耦联碟谷酰胺后的磁性级纳米生物材料不但能够通过肿瘤组织表面特有的高滞留效应来渗透和富集在肿瘤组织之中，还能够通过外加磁场的作用使耦联的生物材料高度富集在肿瘤组织周围区域。如此，结合FR从而主动靶向进入肿瘤细胞的碟谷酰胺修饰的磁性纳米材料成为肿瘤的检测和靶向治疗的理想选择。本研究提示，FR对于叶酸及叶酸类似物均有非常高的亲和特异性，可介导这些物质内吞进入细胞。外源性的叶酸复合物与细胞膜表面的FR特异性结合，周围形成凹陷，进入细胞内形成内涵体。

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〔2014-12-17修回〕

(编辑苑云杰)

〔中图分类号〕R604

〔文献标识码〕A