三叶因子3与生长分化因子-15在甲状腺滤泡性肿瘤中的表达及意义

徐　璇　于世鹏　刘　杰

(山东大学，山东　济南　250100)



三叶因子3与生长分化因子-15在甲状腺滤泡性肿瘤中的表达及意义

徐璇于世鹏1刘杰

(山东大学，山东济南250100)

〔摘要〕目的探讨三叶因子3(TFF3)及生长分化因子-15(GDF-15)在甲状腺滤泡性肿瘤中的表达及意义。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法分别检测甲状腺滤泡状癌(FTC)、甲状腺滤泡性腺瘤(FA)及正常甲状腺(NT)组织中(各30例)TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表达。结果正常甲状腺组织中TFF3 mRNA的表达量明显高于甲状腺滤泡状癌及FA(P<0.01)，而FA中的TFF3 mRNA的表达量明显高于甲状腺滤泡状癌(P<0.05)。甲状腺滤泡状癌及FA中GDF-15 mRNA的表达量明显高于正常甲状腺组织(P<0.01)，而甲状腺滤泡状癌中的GDF-15 mRNA的表达量明显高于FA(P<0.01)。结论TFF3 mRNA的低表达和GDF-15 mRNA高表达可能与甲状腺滤泡性肿瘤发生发展相关，对进一步区分甲状腺滤泡性肿瘤良恶性，提高诊断准确率有重要意义。

〔关键词〕甲状腺滤泡状癌；甲状腺滤泡性腺瘤；三叶因子3；生长分化因子-15；RT-PCR

甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势〔1〕，因而甲状腺恶性肿瘤的确切发病机制及如何快速、有效地鉴别甲状腺良恶性肿瘤已成为目前研究的热点。目前甲状腺细针抽吸活检细胞学检查(FNAB)被认为是术前评估甲状腺肿瘤良恶性的最好诊断工具，但是对于临床甲状腺病理中最难鉴别的滤泡性肿瘤，细胞学检查并不能明确诊断，因而发掘灵敏度高、特异性强的肿瘤标志物成为诸多学者努力的方向。三叶因子(TFF)3为近年来研究较多的一种小分子多肽，其通过影响细胞信号转导、调节细胞凋亡等过程促进或抑制肿瘤的发生、发展。生长分化因子(GDF)-15是转化生长因子-β(TGF-β)超家族中的一员，参与组织胚胎发育、细胞应激响应调控、炎症反应及急性损伤修复等生理病理过程，并对肿瘤的发生、发展起促进或抑制作用。本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法分别检测甲状腺滤泡状癌、甲状腺滤泡性腺瘤(FA)及正常甲状腺组织(甲状腺滤泡性腺瘤周边正常甲状腺组织)中TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表达，探讨其与甲状腺滤泡性肿瘤发生发展的关系及对甲状腺滤泡性肿瘤良恶性的鉴别意义。

1材料与方法

1.1标本来源从2011年9月1日至2013年7月6日在济宁医学院附属医院乳甲外科行手术治疗的甲状腺滤泡状癌、FA患者中随机选取各30例。所有研究对象均经过济宁医学院附属医院伦理委员会审查批准，并与患者及家属签署书面知情同意书。所有患者术前均未接受放化疗、内分泌治疗及其他免疫治疗；RT-PCR标本均于手术切除后0.5 h内采集，迅速置于液氮中保存，0.5 h内转至-80℃冰箱中保存备用，所有标本病理类型在术后均经有经验的病理科专家证实。

1.2方法RT-PCR法测定甲状腺滤泡性肿瘤及正常甲状腺组织中TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表达。首先应用TRIzol试剂盒(Invitrogen)提取100 mg甲状腺组织中的总RNA。紫外分光光度仪测定RNA浓度和纯度，波长280 nm与260 nm读取的吸光度比值在1.8~2.0，表明提取的RNA无明显降解，质量较好，用作RT-PCR模板。然后取5 μg总RNA，逆转录，收集cDNA，用PCR法扩增目的片段，引物由上海生物工程公司设计合成。引物序列TFF3正义链：GACAGTTCTTCGTGCCTGAGA，反义链：GAGTCTTTTCCTGCCCTTGAG；GDF-15正义链：AAGAACTCAGGACGGTGAATG，反义链：CCGCAACTCTCGGAATCTG。RT-PCR反应体系：在PCR专用管中依次加入cDNA 2 μl、正义链引物2 μl、反义链引物2 μl、Supermix 44 μl，共计50 μl，离心半径8.25 cm、1 200 r/min，离心35 min混匀。反应条件：预变性94℃ 2 min进入循环，变性94℃ 30 s，退火TFF3 57℃/GDF-15 55℃ 30 s，复性72℃ 30 s，TFF3 35/GDF-15 32个循环，(β-actin 25个循环，最后72℃ 5 min延伸)，取PCR产物(12.5+2.5)μl DNA上样缓冲液在3%琼脂糖凝胶上电泳，拍照后分析。

1.3统计学方法结果以中位数和四分位数间距表示，采用SPSS13.0软件对两组间比较用两独立样本非参数检验(U-Mann-Whitney检验)，多组间比较行多个独立样本非参数检验。

2结果

见表1、图1。甲状腺滤泡状癌、FA及正常组织中均可检测到TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表达。正常甲状腺组织中TFF3 mRNA的表达量高于甲状腺滤泡状癌(Z=-4.668，P=0.000)和FA(Z=-3.320，P=0.001)，而FA中TFF3 mRNA的表达量高于甲状腺滤泡状癌(Z=-2.522，P=0.0125)。甲状腺滤泡状癌(Z=-4.062，P=0.000)和FA(Z=-2.915，P=0.004)中GDF-15 mRNA的表达量高于正常甲状腺组织，而甲状腺滤泡状癌中GDF-15 mRNA的表达量高于FA(Z=-2.916，P=0.004)。

表1　不同甲状腺组织中TFF3 mRNA及

与正常甲状腺组织比较:1)P<0.01；与FA组织比较:2)P<0.05，3)P<0.01

1~3：正常甲状腺组织；甲状腺滤泡状癌组织；FA组织图1　RT-PCR分析TFF3、GDF-15在不同甲状腺组织中的表达

3讨论

我国人群中甲状腺结节的检出率约为20%~76%，其中又有5%~15%为恶性〔1〕。临床上可通过病史询问、触诊、影像学检查、细针抽吸活检等方法来评估其良恶性。但是对于甲状腺滤泡性肿瘤，术前诊断率不高，通常术后性组织病理学才能确诊。近年来现代分子生物技术的迅猛发展，为我们研究其发病机制提供了技术支持，同时也为找到可靠肿瘤标记物打下坚实基础。因而，通过分子生物技术研究甲状腺滤泡性肿瘤的发病机制及找出灵敏度和特异性兼备的肿瘤标记物成为许多学者奋斗的目标。

人的TFF3基因定位于21q22.3区域，TFF3分子由59个氨基酸组成，含有一个P结构域，其羧基端含有第7个半胱氨酸残基，有利于形成同源二聚体与其他蛋白分子相互作用〔2，3〕。TFF3主要在小肠和结肠的杯状细胞，胃窦黏膜中高表达〔4〕，对黏膜的再生和修复起非常重要的作用，此外它还参与信号转导、调节细胞凋亡、抑制或促进肿瘤发生等过程。目前认为TFF3抑制肿瘤细胞生长的作用机制主要有以下途径：① 降低MAPK/ERK的磷酸化，减少细胞外刺激信号转导致细胞及其核内，从而抑制细胞的增殖、分化及凋亡等生物学反应〔5〕；② 增加细胞周期激酶抑制剂p16INK4和p21CIP1/Waf1水平，两者分别与不同的细胞周期素结合，阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞增殖；③ 抑制 cyclinD1/cdk4 和cyclinE/cdk2 复合物的活性，从而阻止细胞周期中S期的启动，使细胞静止在G1期，进一步抑制细胞增殖〔6〕等。生长分化因子-15是1997年Bootcov等〔7〕从激活的巨噬细胞中发现的TGF-β 超家族的成员，基因定位于19p13.1-13.2，由两个外显子和一个内含子构成。生理情况下，GDF-15只在胎盘及前列腺等少数组织大量表达，当机体荷瘤时，可检测出GDF-15表达增加。多项研究表明，GDF-15在前列腺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、颅内脑瘤、黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤的细胞、血清或脑脊液中表达升高〔8〕。GDF-15可通过以下方面促进促进肿瘤的发生发展：①激活胞内TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体及Smad信号转导蛋白复合体，使其作为转录因子与DNA的信号识别序列CAGAC结合，从而调控细胞增殖〔9〕；②激活细胞内信号分子，如Ras/MAPKs、PI3K/Akt/mTOR信号途径〔10〕，Ras激活后，导致GTPase活性下降，使Ras保持持续活化状态，从而激活下游MAPK级联反应，导致细胞大量增殖而发生恶性转化〔11〕，GDF-15可能为PI3K/Akt/mTOR通路的一个上游靶基因，其能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号途径通路阻止细胞凋亡〔12〕；③抑制树突细胞的成熟，使T细胞增殖活化为效应T细胞过程中的协同刺激分子水平降低，抑制了T细胞的活化，使细胞毒性T细胞介导的抗肿瘤效应减弱，进而促进肿瘤的免疫逃逸〔13〕。

本研究提示TFF3 mRNA在甲状腺滤泡性肿瘤中的表达有一定的特异性，其可能参与了甲状腺滤泡性肿瘤的发生发展过程。其在良恶性不同的甲状腺滤泡性肿瘤中表达不同，提示TFF3 mRNA对甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性的鉴别具有重要参考价值。其在甲状腺滤泡状癌组织中呈低表达状态，提示TFF3可能在甲状腺滤泡性肿瘤的发生发展过程中起到保护机体的作用。这与Krause等〔14〕、Karger等〔15〕、Takano等〔16〕和Patel等〔17〕的观点一致。GDF-15 mRNA在正常甲状腺、FA、甲状腺滤泡状癌组织中均有表达，并且其表达量依次升高，提示GDF-15 mRNA同样也参与了甲状腺滤泡性肿瘤的发生发展过程。其在良恶性不同的甲状腺滤泡性肿瘤中表达也不同，提示GDF-15亦对甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性的鉴别具有重要参考价值。然而GDF-15 mRNA在甲状腺滤泡状癌组织中呈高表达状态，提示GDF-15可能对甲状腺滤泡性肿瘤的发生发展起促进作用，并且可能为甲状腺滤泡状癌病情进展、恶性转移的重要信号。这与Krause等〔14〕和Weber等〔12〕观点一致。并且Krause等〔14〕研究证实联合检测以上两种分子在甲状腺滤泡性肿瘤中的表达可能对其良恶性的鉴别更具参考价值。但是，TFF3与GDF-15具体通过何种途径影响甲状腺滤泡状癌发生发展，仍需大样本量的临床资料统计分析及更深层次的实验室研究。

综上所述，本研究认为，TFF3和GDF-15参与了甲状腺滤泡性肿瘤的发生发展，TFF3可能在此过程中起抑制肿瘤发生发展的作用，而GDF-15可能对其发生发展起促进作用，其核酸水平的检测可为鉴别甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性提供参考依据，这与国外使用不同方法(cDNA arrays，SAGE，adapter-tagged competitive PCR)所得到的研究结果一致〔12，16，18，19〕。因此，推测应用检测TFF3 mRNA和GDF-15 mRNA表达来辅助识别甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性，对甲状腺滤泡性肿瘤的术前诊断具有重要参考价值。

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〔2014-09-15修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

〔中图分类号〕R581.9

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1130-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.050

通讯作者：于世鹏(1963-)，男，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事甲状腺疾病研究。

1济宁医学院附属医院内分泌科

第一作者：徐璇(1988-)，女，硕士，主要从事内分泌与代谢病的研究。