β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马和血清神经元特异性烯醇化酶变化的干预作用

刘得水　兴桂华　卢长方　高志影　张晓杰

(齐齐哈尔医学院，黑龙江　齐齐哈尔　161006)



β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马和血清神经元特异性烯醇化酶变化的干预作用

刘得水兴桂华卢长方高志影张晓杰

(齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔161006)

〔摘要〕目的探讨抑郁模型大鼠海马和血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)变化及石菖蒲有效成分β-细辛醚的干预作用。方法采用慢性轻度不可预见性应激(CUMS)结合孤笼饲养建立稳定、可行的大鼠抑郁症模型；运用旷场实验进行行为学检测；采用免疫组织化学检测对大鼠海马NSE表达量，应用ELISA方法测定血清NSE水平变化。结果与空白对照组大鼠比较，给予28 d的CUMS大鼠的自主活动得分减少，海马区神经元NSE表达量减少(P<0.05)，但血清中NSE水平无显著差异；给予阳性药氟西汀(10 mg·kg-1·d-1)及β-细辛醚(25 mg·kg-1·d-1)均能显著提高CUMS大鼠的自主活动得分，海马CA3区神经元NSE表达量增多(P<0.05)，但对血清中NSE水平无影响。结论β-细辛醚具有明显的抗抑郁作用，可能是通过提高神经元活性，减少神经元损伤，从而实现对CUMS大鼠神经的保护作用。

〔关键词〕抑郁症；β-细辛醚；神经元特异性烯醇化酶

抑郁症(MDD)是一种复杂的异质性疾病。石菖蒲属于醒脑开窍类中药，有效成分主要为挥发油，β-细辛醚是挥发油的主要成分，被认为是其药理作用的主要物质基础，具有明显的神经保护作用〔1〕。本实验建立大鼠MDD模型，观察β-细辛醚对给予慢性轻度不可预见性应激(CUMS)的大鼠脑海马区神元特异性烯醇化酶(NSE)和血清NSE水平的影响，探讨β-细辛醚对CUMS大鼠神经保护的作用机制。

1材料与仪器

1.1实验动物SPF级SD大鼠80只，购买于哈尔滨医科大学实验动物医学部，许可证编号：SCXK(黑)2013-0001。大鼠在动物房中适应环境7 d后开始进行实验。

1.2试剂β-细辛醚(天津一方科技有限公司)；盐酸氟西汀(上海中西制药有限公司)。尼氏染色液(索莱宝科技有限公司)，anti-NSE antibody(EPITOMICS 公司)；免疫组化SP试剂盒(迈新生物技术有限公司)；NSE ELISA试剂盒(博海生物科技有限公司)。

1.3仪器CX41RBSF光学显微镜，PM-20型全自动显微摄影仪，Tecan Safire2酶标仪。

1.4方法

1.4.1动物分组及给药大鼠随机分成4组：对照组：常规饲养；模型组：CUMS+生理盐水；氟西汀组：CUMS+盐酸氟西汀(10 mg·kg-1·d-1)；β-细辛醚组：CUMS+β-细辛醚组(25 mg·kg-1·d-1)，每组20只。对照组不给予药物处理，其余各组在建模起分别口服或灌胃给予生理盐水或相应药物，1次/d，共28 d。

1.4.2建立CUMS抑郁模型对照组每5只大鼠一笼饲养，不给予任何刺激，自由饮水摄食。其余各组每笼饲养1只大鼠，每天随机选用2种应激方式，持续28 d。应激方法参照文献〔2〕并稍行改进，给予CUMS的大鼠单笼孤养，每周互换一次鼠笼。

1.4.3行为学检测旷场实验〔3〕，造模第29天，在安静而且弱光环境下用旷场实验法观察记录大鼠5 min内动作行为表现。

1.4.4免疫组织化学法检测海马NSE表达石蜡切片，脱蜡，脱苯水化；高压修复；H2O2孵育；正常非免疫动物血清孵育；anti-NSE抗体，4℃过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤；二抗孵育，PBS洗涤；加链霉素抗生素蛋白-过氧化酶孵育，PBS洗涤，DAB显色，PBS终止显色；复染，返蓝，透明，封片；显微镜下观察，采集图片。

1.4.5酶联免疫分析法检测血清NSE将板内NSE孔内加入含NSEO的标准物100 μl，取样品稀释液50 μl加入样品孔，孵育，洗板，甩干；加酶标抗体，洗板，甩干；加OPD液，显色；终止反应。在酶标仪上于492 nm波长处检测吸光度，根据标准曲线换算成实际NSE浓度(μg/L)。

1.5统计分析采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、SNK检验。

2结果

2.1β-细辛醚对CUMS大鼠行为学的影响持续给予28 dCUMS刺激之后，模型组大鼠与对照组大鼠相比表现出水平运动与垂直运动得分明显减少(P<0.05)；与模型组比较，β-细辛醚和氟西汀均能增加CUMS大鼠的水平运动与垂直运动得分(P<0.05)。见表1。

表1　β-细辛醚对CUMS大鼠旷场实验垂直运动和

2.2β-细辛醚对海马NSE蛋白表达影响持续给予28 d CUMS刺激之后，采用免疫组化技术检测各组大鼠海马NSE蛋白表达水平。结果显示，与对照组(24.30±3.15)比较，模型组大鼠海马NSE蛋白表达(10.09±3.56)减少(P<0.05)。与模型组比较，β-细辛醚(18.28±4.90)及阳性药氟西汀(19.77±4.46)均可提高NSE蛋白表达(P<0.05)。

2.3β-细辛醚对CUMS大鼠血清NSE水平的影响持续给予28 d的UMS之后，与对照组〔(3.44±0.53)ng/L〕比较，模型组大鼠血清NSE水平〔(3.69±0.61)ng/L〕无显著性差异(P>0.05)；与模型组相比，给药组大鼠血清NSE水平〔氟西汀组(3.42±0.64)ng/L，β-细辛醚组(3.51±0.82)ng/L〕也无显著性差异(P>0.05)。

3讨论

现代医学研究发现，应激性生活事件是MDD发生的促发因素〔4〕，在一个新奇的环境中动物会产生类似焦虑的抑郁样表现，动物的这种焦虑反应经抗抑郁药物治疗后可以有所缓解，表现为水平运动和垂直运动减少，因此，通过行为学实验检测可应用于抗抑郁药物的筛选以及药效的初步评价。本研究表明β-细辛醚能够显著改善CUMS大鼠的焦虑症状，具有明显的抗抑郁作用。

NSE是烯醇化酶基因超家族的一员，可催化2-磷酸甘油酸到磷酸烯醇式丙酮酸的转化，是糖酵解过程中的关键酶〔5〕。烯醇化酶主要由α、β、γ三个亚基组成的二聚体，而γ亚基特异性存在于神经元和神经来源的细胞中，故被命名为NSE〔6〕。NSE在正常体液中含量很低，在脑组织中分布最多〔7〕，已成为神经元损伤的特征性标志物。夏军等〔8〕研究发现，抑郁模型大鼠NSE表达减弱，而经过药物治疗后大鼠的NSE表达增强，Abumaria等〔9〕发现使用抗抑郁剂能够提高抑郁样症状大鼠海马NSE mRNA表达。通过本研究可以推测，β-细辛醚通过提高海马神经元NSE表达，增加神经元的能量供应，从而对给予CUMS的大鼠起到神经保护作用。

4参考文献

1Dong H，Gao Z，Rong H，etal.Beta-asarone reverses chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and promotes hippocampal neurogenesis in rats〔J〕.Molecules,2014;19(5)：5634-49.

2Autry AE，Adachi M，Nosyreva E，etal.NMDA receptor blockade at rest triggers rapid behavioural antidepressant responses〔J〕.Nature，2011;475(7354):91-5.

3Warner-Schmidt JL，Duman RS.VEGF is an essential mediator of the neurogenic and behavioral actions of antidepressants〔J〕.Proc Nat Acad Sci，2007;104(11):4647-52.

4赵幸福，徐一峰.生活事件与抑郁症〔J〕.上海精神医学，1995;7：209-11.

5Orlino EN，J Olmstead CE，Lazareff JA，etal.An enzyme immunoassay for neuron-specific enolase in cerebrospinal fluid〔J〕.Biochem Molecular Med，1997;61(1):41-6.

6Tracy MR，Hedges SB.Evolutionary history of the enolase gene family〔J〕.Gene，2000;259(1-2):129-38.

7Hein Nee Maier K，Kohler A，Diem R，etal.Biological markers for axonal degeneration in csf and blood of patients with the first event indicative for multiple sclerosis〔J〕.Neuroscience Letters，2008;436(1):72-6.

8夏军，雷益，周义成.慢性应激大鼠抑郁症模型的免疫组织化学和MRI研究〔J〕.武汉大学学报，2006;127(1)：83-6.

9Abumaria N，Rygula R，Hiemke C，etal.Effect of chronic citalopram on serotonin-related and stress-regulated genes in the dorsal raphe nucleus of the rat〔J〕.Eur Neuropsychopharmacol J Eur Coll Neuropsychopharmacol，2007;17(6-7):417-29.

〔2015-12-03修回〕

(编辑郭菁/滕欣航)

〔中图分类号〕R749.4

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1040-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.007

通讯作者：张晓杰(1965-)，女，教授，博士生导师，博士，主要从事神经精神疾病的病理学研究。

基金项目：黑龙江省自然科学基金项目(H201354)

第一作者：刘得水(1981-)，男，助理实验师，主要从事神经精神疾病的病理学研究。