黄精多糖联合低剂量顺铂对小鼠H22肝癌移植瘤生长的抑制及其抗氧化损伤作用

李超彦　周媛媛　王福青

(漯河医学高等专科学校基础医学部，河南　漯河　462002)



黄精多糖联合低剂量顺铂对小鼠H22肝癌移植瘤生长的抑制及其抗氧化损伤作用

李超彦周媛媛王福青

(漯河医学高等专科学校基础医学部，河南漯河462002)

〔摘要〕目的观察黄精多糖(PSP)联合低剂量顺铂对小鼠H22肝癌移植瘤生长的影响及其抗氧化损伤作用，并探讨其机制。方法72只小鼠右腋皮下注射H22肝癌细胞建立荷瘤模型，随机分为对照组、PSP小剂量组(10 g/kg)、PSP大剂量组(30 g/kg)、顺铂组(2.5 mg/kg)、PSP小剂量+顺铂组、PSP大剂量+顺铂组；末次给药24 h后处死小鼠，通过称重移植瘤的质量，计算抑瘤率；通过称重肝脏的质量，计算肝脏系数；测定肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的含量；同时观察肝脏组织学结构变化。结果与对照组比较，顺铂组及PSP+顺铂组均显著降低移植瘤重(P<0.05或P<0.01)，且随着PSP剂量增大及与顺铂合用抑瘤率逐渐提高；与对照组比较，顺铂干预后肝脏质量及肝组织匀浆中SOD水平明显降低(P<0.01)，而MDA含量明显升高(P<0.01)；与顺铂组比较，PSP联合顺铂干预后肝脏质量及肝组织匀浆中SOD水平逐渐升高(P<0.05或P<0.01)，且MDA含量降低(P<0.01)。结论黄精多糖与顺铂联合使用可明显抑制H22肝癌移植瘤的生长，并能减轻顺铂引发的肝脏氧化损伤。

〔关键词〕黄精多糖；顺铂；肝癌；氧化损伤；超氧化物歧化酶(SOD)；丙二醛(MDA)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，术后复发和转移率极高，故化疗在肝癌的综合治疗中仍占重要地位〔1〕。顺铂是临床上常用的周期非特异性重金属类抗癌药，对肝癌等各类实体瘤均具有较强的抑制和杀伤作用，但其严重的细胞毒作用引发的脏器功能氧化损伤限制了其广泛应用〔2,3〕。目前，临床上通常在使用化疗药物的同时配合抗氧化中药，不仅能起到增效增敏作用，还能减轻化疗药物的毒副反应。黄精多糖(PSP)是黄精水提物的主要有效成分和生物学活性成分之一，研究表明其具有增强免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化作用〔4,5〕等多种药理作用。本文以H22荷瘤小鼠为动物模型，观察PSP联合低剂量顺铂对小鼠H22移植瘤生长的影响及PSP对顺铂所致肝癌小鼠肝脏氧化损伤的保护作用。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级昆明小鼠，72只，雄性，6~8周龄，体重18~22 g，由郑州大学医学院实验动物中心提供(合格证号医动字第20110118号)。

1.2细胞株H22肝癌细胞由本校分子医学实验中心提供，小鼠腹水传代。

1.3药品与试剂PSP，浓度50%，由陕西杨凌东科麦迪森制药有限公司提供。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号20110307)。顺铂冻干粉(批号11010161，20 mg)，齐鲁制药有限公司生产，临用前0.9%氯化钠溶液配制。

1.4仪器721-分光光度计(上海第三分析仪器厂)，超低温冰箱(美国ThermoForma702)，AU2700全自动生化分析仪(日本奥林巴斯公司)，MSE-25型高速冷冻离心机(上海科学仪器厂)，Leica DMIL倒置显微镜(德国莱卡仪器有限公司)。

1.5方法

1.5.1动物模型建立昆明小鼠腹腔接种H22细胞，培养1 w后抽取腹水，显微镜下细胞计数器上计数并用无菌生理盐水调整细胞密度至5×109个/L，每只小鼠右腋皮下注射0.2 ml H22肝癌细胞，制成实体型荷瘤鼠模型。

1.5.2分组及给药将72只造模成功荷瘤小鼠随机分为6组，每组12只。对照组(灌胃生理盐水0.3 ml)；PSP小剂量组(灌胃10 g/kg)；PSP大剂量组(灌胃30 g/kg)；顺铂组(腹腔注射2.5 mg/kg)；PSP小剂量+顺铂组(灌胃PSP 10 g/kg，同时给予顺铂腹腔注射2.5 mg/kg)；PSP大剂量+顺铂组(灌胃PSP 30 g/kg，同时给予顺铂腹腔注射2.5 mg/kg)。以上给药均为1次/d，连续10 d。

1.5.3一般状况观察小鼠接种肿瘤及给药期间，每天观察小鼠皮毛、食欲、活动状况，对刺激的反应及体重变化情况，评价化疗毒副反应及生存质量。

1.5.4瘤重及抑瘤率测定末次给药24 h后，颈椎脱臼法处死小鼠并称重，完整剥取移植瘤，用滤纸擦拭干净后电子天平称重，并依公式计算抑瘤率。

1.5.5肝脏指数测定各组小鼠处死后剪取肝脏并称重，计算肝脏指数：肝脏质量(g)/体重(g)×100%。

1.5.6肝组织匀浆生化测定计算肝脏系数后剪取0.1 g肝组织，剪碎后加冰生理盐水研磨成10%组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液置4℃冰箱备测SOD、MDA，SOD、MDA的测定均严格按试剂盒说明书进行。

1.5.7组织病理学观察取小鼠肝脏组织，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，厚度5 μm，行苏木精-伊红(HE)染色，光镜观察肝脏组织学形态变化。

1.6统计学处理采用SPSS13.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1荷瘤小鼠一般状况观察实验过程中，通过观察小鼠精神状态、活动状况、对刺激的反应、食欲及消瘦幅度、被毛脱落等指标，评价小鼠的生存质量。结果表明：对照组及PSP各组小鼠生存质量较好，未见明显的不良反应；顺铂组小鼠生存质量较差，不良反应明显，出现厌食、腹泻、精神萎靡、消瘦及脱毛等症状；PSP+顺铂联合用药组好于单独顺铂组，不良反应相对较少。实验结束时，除PSP大剂量组以外的各组小鼠均有死亡，表现为体重明显下降，排除感染或饲养不当的因素外，推测小鼠死亡原因为自身体质过差引起，但各组小鼠死亡率差异并无统计学意义(P>0.05)。

2.2移植瘤重及抑瘤率接种后1 w内小鼠外观变化不明显，1 w后各组均可触及右腋下瘤块，对照组小鼠移植瘤生长迅速、局部肿胀压迫明显；各药物治疗组小鼠移植瘤生长较对照组缓慢，各组移植瘤重均低于对照组(P<0.05或P<0.01)。各剂量联合用药组与单独用药组两两比较，移植瘤重差异显著(P<0.01)。见表1。

2.3肝脏质量、肝脏系数及肝组织匀浆生化指标的变化与对照组比较，顺铂组及PSP各剂量与顺铂联合组肝脏质量明显下降(P<0.05或P<0.01)，肝脏系数减小；肝脏组织匀浆中SOD明显下降(P<0.05或P<0.01)，MDA含量明显升高(P<0.05或P<0.01)；PSP大剂量组可升高肝脏组织匀浆中SOD水平(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)。与顺铂组比较，PSP各剂量与顺铂联合组肝脏质量逐渐增大(P<0.05或P<0.01)，肝脏系数变大；肝脏组织匀浆中SOD明显升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.01)。见表2。

2.4肝组织病理结构变化肝脏HE染色切片显示，对照组小鼠肝组织结构略疏松，间质有少量炎症细胞浸润；与对照组比较，顺铂组小鼠肝组织结构明显疏松，细胞排列不整齐，胞质丰富且有空泡，部分细胞呈气球样变性，门管区出现淋巴细胞浸润及纤维组织增生；与顺铂组比较，PSP联合顺铂组小鼠肝损伤有明显改善，肝细胞气球样变及炎性细胞浸润明显减少，可见正常肝索结构及纤维化增生减轻。

表1　各组小鼠移植瘤重和抑瘤率比较±s)

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与PSP小剂量组比较：3)P<0.01；与PSP大剂量组比较：4)P<0.01；与顺铂组比较：5)P<0.01

表2　各组小鼠的肝脏质量、肝脏系数和肝组织SOD、MDA的变化

与对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01；与顺铂组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

3讨论

据国际癌症研究中心(IARC)报道，每年肝癌发病率和死亡数占全球肝癌病例的一半以上〔6〕。顺铂是一种广谱铂类抗癌剂广泛应用于临床，同样在肝癌的化疗中占有重要的地位；其主要通过肿瘤细胞DNA链结合，形成交叉连接，抑制DNA、RNA的合成和细胞分裂，从而导致肿瘤细胞分裂障碍而死亡，为周期非特异性肿瘤化疗药物〔2〕。顺铂的抗肿瘤效应具有明显的剂量依赖性，剂量越大，杀伤肿瘤效应越强〔3〕；但顺铂大剂量应用易引发严重的毒副反应〔7〕，主要表现为对肝脏、肾脏等脏器功能的损害〔3,8〕。顺铂致肝脏毒副作用机制尚不明确，可能与其所致脂质过氧化反应增强有关；表现为组织氧化代谢产物MDA水平升高、SOD水平降低，细胞内代谢废物堆积，引发肝细胞变性、灶性坏死、凋亡，导致急性肝功能障碍等一系列肝脏毒性反应〔7〕。因此增强机体抗氧化功能、降低脂质过氧化反应可能是减小顺铂所致肝脏毒性作用的研究方向之一。

PSP是黄精主要的生物学活性成分，增强免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化作用等多种药理作用，近年来研究发现PSP对实体移植具有明显的抑制作用〔5〕，且对化学性肝功能损伤具有保护作用〔9〕。顺铂的抗肿瘤效应虽有明显的剂量依赖性，但采用低剂量(通常为最大耐受剂量的1/10~1/3)、长时间连续或高频率给药模式，也可产生显著的抑瘤效果，且毒性反应较小〔10,11〕；鉴于PSP和顺铂的上述特点，在肿瘤化疗中联合用药理论上是可行。

本研究结果显示：顺铂组低剂量高频率顺铂化疗虽然取得良好的抑瘤效果，明显高于PSP各组及对照组，但在整个用药期间小鼠一般状况表现不佳，出现厌食、腹泻、精神萎靡、消瘦及脱毛等症状，且对肝脏功能的损害表现也很突出，如肝脏质量、肝脏系数、SOD水平的下降及MDA水平的增高。PSP各剂量单独用药时，对移植瘤的生长表现出一定的抑制效果，用药期间小鼠的一般状况表现良好，体重增加，且对肝功能损伤呈现出保护作用。PSP与顺铂联合用药小鼠对移植瘤的抑瘤效果最佳，瘤重明显低于对照组及顺铂组，且随着PSP剂量增大合用的抑瘤效果更佳，抑瘤率最高达86.27%；小鼠用药期间的生存质量良好，精神状态、消瘦幅度及脱毛等症状尚可；小鼠肝功能的损伤程度远小于顺铂单独使用，提示PSP的应用可以减轻顺铂所致的肝功能损伤，表现为肝脏质量、肝脏系数、SOD水平的回升及MDA水平的下降。

PSP与顺铂联合用药组的抑瘤率高于顺铂组，提示PSP与顺铂的联合应用对移植瘤的生长具有不同程度的协同抑制效果，增强了抑瘤能力。顺铂是通过抑制肿瘤细胞DNA、RNA的复制和碱基错配导致细胞分裂障碍而死亡，达到抑制肿瘤生长的作用〔2〕；PSP组成成分及结构复杂，其抗肿瘤机制目前尚不明确，推测与其增强机体免疫功能、提高机体应激及抗氧化能力等活性有关〔5〕；PSP与低剂量顺铂联合应用后的协同增效作用及对肝功能的保护作用，其机制可能与顺铂引发肿瘤细胞DNA的损伤、PSP增强机体免疫系统功能及抗氧化能力有关，二者协同抑制了肿瘤细胞的分裂，并诱导了肿瘤细胞的凋亡，其具体机制尚待进一步研究证实。

4参考文献

1Pitot HC. Adventures in hepatocarcinogenesis〔J〕. Ann Rev Pathol,2007;2:1-29.

2Gonzalez VM,Fuertes MA,Alonso C,etal. Is cisplatin-induced cell death always produced by apoptosis〔J〕?Mol Pharacol,2001;59(4):657-63.

3Stewart JD,Bolt HM. Cisplatin-induced nephrotoxicity〔J〕. Arch Toxicol,2012;86(8):1155.

4张庭廷,夏晓凯,陈传平,等. 黄精多糖的生物活性研究〔J〕.中国实验方剂学杂志,2006;2(7):42.

5江华. 黄精多糖的抗肿瘤活性研究〔J〕.南京中医药大学学报,2010;26(6):479-80.

6芮静安. 原发性肝癌的治疗研究新进展〔J〕.临床肝胆病杂志,2006;22(4):244-6.

7刘秀均,刘婷. 苦参碱联合顺铂抗肝癌的实验研究〔J〕.中国实验方剂学杂志,2007;13(6):37.

8罗景慧,杨迎暴. N-乙酰半胱氨酸对顺铂诱导急性肾损伤后肾脏组织氧化应激水平的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2012;18(19):170.

9雷震,杨光义,叶方,等. 黄精多糖药理作用及临床应用研究概述〔J〕.中国药师,2012;15(1):114-6.

10侯继院,沈方臻,王延涛,等. 顺铂低剂量节律化疗抑制小鼠H22肝癌血管生成观察〔J〕.齐鲁医学杂志,2008;23(2):95-8.

11Emmenegger U,Man S,Shaked Y,etal.A comparative analysis of low-dose metronomic cyclophosphamide reveals absent or low grade toxicity on tissues highly sensitive to the toxic effects of maximum tolerated dose regimens〔J〕. Cancer Res,2004; 64(11):3994-4000.

〔2014-11-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1038-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.006

基金项目：河南省教育厅自然科学研究资助项目(2009C310008)

第一作者：李超彦(1981-)，男，讲师，硕士，主要从事生理学研究。