高效液相色谱法同时测定抗骨增生胶囊中的毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷

朱燕，黄义纯，严晓明

(韶关市食品药品检验所，广东 韶关 512028)



药物分析

高效液相色谱法同时测定抗骨增生胶囊中的毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷

朱燕，黄义纯，严晓明

(韶关市食品药品检验所，广东 韶关 512028)

目的 建立同时测定抗骨增生胶囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3种成分质量分数的高效液相色谱法。方法 采用依利特Hypersil ODS2色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以水(A)、甲醇(B)、乙腈(C)为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为270 nm，柱温为30 ℃。结果 毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷测定的线性范围分别为5.02～100.4、7.38～147.6 和5.20～104.0 μg/mL，r值均大于0.999，平均加样回收率分别为100.7%、100.4%和99.3%，RSD值均小于2.0%(n=6)。结论 本方法简便、结果准确，可有效地控制抗骨增生胶囊的质量。

高效液相色谱； 抗骨增生胶囊； 毛蕊花糖苷； 柚皮苷； 淫羊藿苷

抗骨增生胶囊为国家基本医疗保险药品目录收载品种,是由熟地黄、鸡血藤、酒肉苁蓉、炒莱菔子、狗脊、骨碎补、女贞子(盐制)、淫羊藿、牛膝9味中药制成的中药成方制剂,收载于《中国药典》2015年版一部[1]950，用于增生性脊椎炎(肥大性胸椎炎，肥大性腰椎炎)、颈椎综合征和骨刺等疾病[2]。熟地黄、淫羊藿、骨碎补均为该复方制剂的主要药味，其主要活性成分分别为毛蕊花糖苷(verbascoside)、淫羊藿苷(icariine)等黄酮类和柚皮苷(naringin)等二氢黄酮类化合物[1]256，124，其药效与该制剂功能主治相一致。抗骨增生胶囊现行标准[1] 950仅对淫羊藿苷进行质量分数测定，未能全面控制其质量，国内亦未见对抗骨增生胶囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3种有效成分质量分数同时进行测定的报道及文献。为了较全面控制抗骨增生胶囊质量并简化其测定方法，笔者参考文献[1] ，[2-4]，以毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷为指标性成分，采用HPLC法同时测定它们在抗骨增生胶囊中的质量分数，以控制方中熟地黄、淫羊藿、骨碎补等主药的质量。

1 仪器与试药

Agilent1260 高效液相色谱仪(包括VWD 检测器LC solution 工作站)，AG-135 电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，HT-300BQ 超声仪(山东济宁恒通超声电子设备有限公司)，Shimadzu UV-2450 紫外分光光度计。

毛蕊花糖苷对照品(批号111530-201512,质量分数96.7%)、柚皮苷对照品(批号110722-201312,质量分数94.7%)、淫羊藿苷对照品(批号110737-201516,质量分数94.2%)均购自中国食品药品检定研究院，抗骨增生胶囊购自江苏康缘药业股份有限公司(0.35 g/丸，批号：141105、141209、150501)。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为依利特Hypersil ODS2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为H2O(A)-甲醇(B)-乙腈(C)，按表1程序进行梯度洗脱。检测波长为270 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃。

表1 抗骨增生胶囊中3种有效成分测定的梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution program of three active ingredients in Kanggu Zengsheng capsules

t/minφ(流动相A)/%φ(流动相B)/%φ(流动相C)/%08002013800201470525267052528800203780020

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别取毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷对照品适量，精密称定，用50%乙醇(体积分数，下同)溶解并定量稀释制成质量浓度分别为0.502、0.738、0.520 mg/mL 的溶液，作为对照品储备溶液。分别精密量取上述3种对照品储备溶液2 mL，置于同一20 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，作为毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷质量浓度分别为0.050 2、0.073 8、0.052 0 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取抗骨增生胶囊内容物10粒，精密称定，混匀，研细,取约0.7 g，精密称定。置具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇50 mL，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)45 min，放冷，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方量制备缺熟地黄、淫羊藿和骨碎补的样品，同“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别精密吸取混合对照品、供试品、阴性样品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，见图1。结果理论塔板数按毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷计算均不低于3 500，3种成分色谱峰与相邻峰之间分离度均大于1.5，对称因子在0.95～1.05 内；阴性对照无干扰。

t/min6040200200150100500806040200mAUmAUmAUABC12332110152025303505

1.毛蕊花糖苷； 2.柚皮苷； 3.淫羊藿苷。

图1 混合对照品(A)、供试品(B)和阴性样品(C)溶液的HPLC色谱图

Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A),sample(B) and negative sample(C)

2.4 线性关系的考察

分别精密量取毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷对照品储备液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL，置于同一25 mL容量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。以峰面积(A)对质量浓度(ρ)进行线性回归，得到3种成分的回归方程、r及线性范围，结果见表2。

表2 抗骨增生胶囊中3种成分的回归方程、r值及线性范围

Table 2 Regression equations,rvalues and linear ranges of three constituents in Kanggu Zengsheng capsules

成分回归方程r线性范围/(μg·mL-1)毛蕊花糖苷A=8.422ρ+19.231230.99925.02～100.4柚皮苷A=8.317ρ+20.125380.99967.38～147.6淫羊藿苷A=20.971ρ+25.361840.99965.20～104.0

2.5 检测限的测定

将“2.4”项下质量浓度最低的对照品溶液逐级稀释，依法进行测定，当各成分峰的信噪比为3∶1时，计算得毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷的最低检测限分别为0.22、0.30、0.13 ng。

2.6 精密度试验

取同一批供试品溶液(批号：150501)10 μL，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件测定并记录色谱图。结果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面积平均值的RSD值(n=6)分别为0.72%、0.77%、0.58%，表明本法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一批供试品溶液(批号：150501)，分别于制备后0、4、8、12、16、20、24 h进样，按“2.1”项下色谱条件测定并记录色谱图。结果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面积平均值的RSD值(n=7)分别为0.82%、0.68%、0.79%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性试验

平行取同一批抗骨增生胶囊(批号：150501) 共6 份，每份0.7 g，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定并记录峰面积。结果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面积的RSD 值分别为1.5%、1.2%和1.0%，表明方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

分别取已知质量分数(毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷分别为0.39、0.56、0.51 mg/丸)的抗骨增生胶囊(批号：150501)约0.7 g，精密称定，共6份，分别精密加入3种对照品储备液0.5 mL，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定并计算回收率。结果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷的平均加样回收率分别为100.7%、100.4%、99.3%，RSD值(n=6)分别为1.7%、1.6%、1.3%。结果见表3。

表3 抗骨增生胶囊中3种有效成分的加样回收率试验结果Table 3 Recovery results of three active ingredients in Kanggu Zengsheng capsules (n=6)

2.10 样品的测定

分别取3批抗骨增生胶囊(批号：141105、141209、150501)，约0.7 g，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每批平行处理3份，按“2.1”项下色谱条件测定，按峰面积外标法计算其中3种有效成分的质量分数，结果见表4。

表4 抗骨增生胶囊中3种有效成分的质量分数测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择

由于抗骨增生胶囊中各成分性质差异较大，为使3种有效成分达到良好分离效果，笔者分别以不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%(体积分数)醋酸等为流动相系统[4-7]对色谱条件进行考察，但分离效果均不甚理想。如以乙腈-水(体积比20∶80)为流动相时，毛蕊花糖苷、柚皮苷出峰好，但淫羊藿苷保留时间过长，而且杂质分离效果差，峰形较差；经过进一步对比研究，最终选择甲醇-乙腈-水三相系统为流动相梯度洗脱，可消除杂质对被测成分的干扰，各成分的色谱峰峰形对称、理论塔板数高、分离度好，缩短了多成分检测的分析时间。

3.2 波长的选择

采用紫外可见分光光度法检测毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷对照品溶液，以初始比例流动相为空白，在200～400 nm范围内进行扫描，兼顾多种成分的最大吸收，重点考察334、284、270 nm波长处的效果。结果发现在270 nm波长处，3种有效成分均有较强吸收，因此选择淫羊藿苷的最大吸收波长270 nm作为检测波长，可同时得到3种成分较好的色谱峰，并能满足定量测定的要求。

3.3 样品前处理方法的确定

笔者分别对文献中较常见的冷浸法、回流提取法、超声法[4-7]这3种提取方法方法进行了考察，结果显示：采用冷浸法提取时，为获得较好的效果，需不定期振摇，且浸泡时间长、提取效率较低；回流提取40 min可基本提取完全，但提取温度较高，可能对其活性成分产生较大的影响，活性成分质量分数随着温度的提高均有不同程度的降低[8]；而超声法可在30 min内基本提取完全，且具有提取时间短、提取温度低、提取率高等特点，所以选用超声法提取。考察了提取时间分别为15、30、45、60 min时的超声提取效果，结果表明，超声处理30 min 后各成分质量分数不再增加，考虑到样品间的差异性，选择超声处理45 min。在提取溶剂方面，分别采用乙醇、50%乙醇、50%甲醇、甲醇作为溶剂对样品进行提取。结果表明：50%甲醇和50%乙醇超声提取完全且杂质干扰峰较少，结果差异不大；但甲醇毒性较乙醇大，结合经济实用的角度考虑，选择50%乙醇作为提取溶剂。

本文所确定方法操作简便、重复性好、准确稳定，能快速、准确地对抗骨增生胶囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3种成分同时进行定量测定，为该制剂质量标准的提高提供了重要参考。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部[M]．北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 朱静，杨青青.抗骨增生胶囊中柚皮苷的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志,2013，44(8):795.

[3] 韩丽萍，陈行愉，刘志刚.HPLC法同时测定抗骨质疏松中成药中柚皮苷及淫羊藿苷的含量[J].中国药房,2010，21(43):4083-4085.

[4] 韩丽萍，陈行愉，邓伟民.HPLC法同时测定补肾壮骨颗粒中淫羊藿苷及柚皮苷含量[J].中成药，2011，33(1)：184-186.

[5] 薛标强，袁洁丽.HPLC法测定抗骨增生片中柚皮苷的含量[J].轻工科技，2014，1(1):105-106.

[6] 徐灿辉，何维为，何云飞.HPLC 法测定六味地黄胶囊中的毛蕊花糖苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚[J].现代药物与临床,2014,37(3):257-259.

[7] 张智军，崔华，马久太.HPLC 法测定抗骨增生片中柚皮苷含量[J].世界中医药，2012，7(4):360-361.

[8] 王亮，张巧艳，年华，等.用HPLC法测定地黄叶中毛蕊花糖苷的含量[J].药学服务与研究,2015，15(1):26，30，46.

(责任编辑：刘晓涵)

Simultaneous determination of verbascoside,naringin and icariin in Kanggu Zengsheng capsules by HPLC

ZHU Yan,HUANG Yichun,YAN Xiaoming

(ShaoguanInstituteforFoodandDrugControl,Shaoguan512028,China)

Objective To establish an HPLC method for determinations of three constituents(verbascoside,naringin and icariin ) in Kanggu Zengsheng capsules. Methods HPLC gradient elution method was applied. The column was Elite Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm,5 μm). The mobile phase was water(A),methanol(B)and acetonitrile(C) solution. The detection wavelength was set at 270 nm and the column temperature was 30 ℃. Results The linear range was 5.02-100.4 μg/mL for verbascoside,7.38-147.6 μg/mL for naringin and 5.20-104.0 μg/mL for icariin,respectively. All the correlation coefficients were above 0.999. The average recovery was 100.7% for verbascoside,100.4% for naringin,and 99.3% for icariin,respectively,and all RSD values were less than 2.0%(n=6). Conclusion The developed HPLC method could be used for the quality control of Kanggu Zengsheng capsules.

HPLC; Kanggu Zengsheng capsules； verbascoside; naringin；icariin

2016-06-23

朱燕(1983—)，本科，主管药师，从事药品质量检验与质量控制研究，Email：29711825@qq.com；通信作者：严晓明(1979—)，副主任药师，从事药品质量检验与质量控制研究，Email：99075234@qq.com。

时间：2016-09-30 15:09

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1509.009.html

R284.1

A

1006-8783(2016)05-0589-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062301