白藜芦醇对哮喘小鼠磷脂酶A2活性和气道炎症的影响

王经韵，邱心敏，罗夏炯，陈小夏，何冰

(1.广东省人民医院 国家临床药物实验机构办公室，广东 广州 510080； 2.广东药科大学 药学院，广东 广州 510006)



药理学

白藜芦醇对哮喘小鼠磷脂酶A2活性和气道炎症的影响

王经韵1，邱心敏2，罗夏炯2，陈小夏2，何冰2

(1.广东省人民医院 国家临床药物实验机构办公室，广东 广州 510080； 2.广东药科大学 药学院，广东 广州 510006)

目的 探讨白藜芦醇对哮喘小鼠磷脂酶A2活性和气道炎症的影响。方法 采用卵清蛋白(OVA)刺激，建立小鼠哮喘模型，测定哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及嗜酸粒细胞(EOS)计数；紫外分光光度法测定肺组织中前列腺素E2(PGE2)的含量；盐酸滴定法测定肺组织和血清中磷脂酶A2活性。结果 白藜芦醇能显著减少哮喘模型小鼠BALF中白细胞总数及EOS计数，减少肺组织中PGE2含量，降低磷脂酶A2活性。结论 白藜芦醇对哮喘小鼠有保护作用，可能与其降低磷脂酶A2活性、减轻炎性细胞浸润、减少炎症介质PGE2的产生有关。

白藜芦醇； 支气管哮喘； 炎症细胞； 前列腺素E2； 磷脂酶A2

支气管哮喘是以慢性气道炎症为特征的疾病。在哮喘的发病中，磷脂酶A2(PLA2)作为催化磷脂二位酰基水解的酶，对白三烯、前列腺素及血小板激活因子等炎性介质的生成及炎症细胞浸润有重要作用，并参与了哮喘的一系列病理生理过程[1]。白藜芦醇属于非黄酮类的多酚化合物，前期的研究表明白藜芦醇具有防治肺部疾病的作用[2-3]，对支气管平滑肌有松弛的作用[4]以及减少哮喘相关炎症介质的产生[5]。本研究通过观察哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞数、肺组织中前列腺素E2(PGE2)含量及PLA2活性，进一步探讨白藜芦醇的抗炎平喘作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性KM小鼠50只，体质量(20±2) g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0020。

1.2 实验药品与试剂

白藜芦醇(碧云天生物技术研究所，批号20141224)；卵清白蛋白(上海源叶生物科技有限公司，批号KAO431YA25)；地塞米松磷酸钠注射剂(广州白云山天心制药有限公司，批号20141027)；卵磷脂(上海源叶生物科技有限公司，批号20140325)，其他试剂均为国产分析纯。抗原液：含卵白蛋白125 mg和氢氧化铝1 mg。

1.3 实验仪器

WH-2000超声波雾化器(汕头市粤华医疗器械厂有限公司)；ZC-10智能型超级恒温水槽装置(宁波天恒仪器厂)；PHS-25(数显)pH计(上海精密科学仪器有限公司)；752/752N 紫外可见分光光度计(杭州汇尔仪器设备有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 小鼠哮喘模型的建立与给药 50只小鼠随机分5组，分别为空白组、模型组、白藜芦醇高剂量组(50 mg/kg)、白藜芦醇低剂量组(25 mg/kg)、地塞米松阳性对照组(5 mg/kg)。参照文献[6]建立小鼠哮喘模型，除空白组外，其他各组分别于第1、7、14天腹腔注射10%(φ)卵白蛋白(OVA)抗原液0.2 mL，第15天开始将各组小鼠置于雾化箱中(空白组以生理盐水雾化攻击)以1%OVA雾化激发，使小鼠出现挠鼻、安静少动、弓背、喘促、腹肌凹陷等急性哮喘发作症状，每天1次，每次30 min，连续1周。药物组和阳性对照组于实验第15天开始灌胃给药，空白组与哮喘模型组给予等容积的生理盐水，每次雾化激发前半小时进行药物干预，连续7 d。

1.4.2 标本采集与检测 小鼠最后一次雾化激发后1 h，小鼠眼眶取血。处死小鼠后，行支气管插管，用生理盐水反复灌洗双肺3次，回收灌洗液，于4 ℃下1 000 r/min离心10 min，弃上清，细胞用1 mL Hank液重悬，取0.1 mL充板计白细胞总数，涂片，刘氏染色，计数200个细胞作细胞分类计数。取肺组织制备1%肺组织匀浆，将肺组织匀浆0.3 mL置于试管内，参照文献[7]，用紫外分光光度法检测PGE2，以吸光度(A)值表示PGE2。取肺组织匀浆0.3 mL及血清0.3 mL，参照文献[8]，用盐酸滴定法测定肺组织和血清中PLA2的活性，以在37 ℃每分钟每毫升样本反应消耗1 nmol/L盐酸为1个PLA2活性单位(U)。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 白藜芦醇对哮喘小鼠全身症状的影响

空白组小鼠行为活动正常；模型组小鼠在卵蛋白雾化激发过程中出现呼吸加深快、点头呼吸、面部瘙痒挠鼻、前肢缩抬、站立不稳等急性哮喘发作表现；药物组及阳性对照组小鼠的急性哮喘症状明显改善。

2.2 白藜芦醇对哮喘小鼠BALF中白细胞总数和嗜酸粒细胞(EOS)计数的影响

结果见表1。模型组BALF中白细胞总数及EOS计数均高于空白组，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；白藜芦醇高、低剂量组明显减少哮喘小鼠BALF中白细胞总数及EOS计数，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

表1 白藜芦醇对哮喘小鼠BALF中白细胞总数和EOS计数的影响

组别剂量/(mg·kg-1)白细胞总数/(×107·L-1)EOS/(×107·L-1)空白组-58.06±23.40107.78±4.42模型组-182.50±57.03☆☆115.38±4.61☆白藜芦醇 低剂量2595.42±50.30**109.79±6.65* 高剂量5082.36±53.27**106.01±3.761*地塞米松组5100.14±34.61**105.70±2.65*

与空白组比较：☆P<0.05，☆☆P<0.01； 与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

2.3 白藜芦醇对哮喘小鼠肺组织中PGE2含量的影响

结果见表2。模型组肺组织中PGE2含量升高，与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；白藜芦醇高、低剂量组均可降低肺组织中PGE2含量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 白藜芦醇对哮喘小鼠肺组织中PGE2含量的影响

组别剂量/(mg·kg-1)A空白组-0.12±0.01模型组-0.16±0.01☆白藜芦醇低剂量组250.15±0.01*高剂量组500.14±0.01*地塞米松组50.13±0.01*

与空白组比较：☆P<0.05； 与模型组比较：*P<0.05。

2.4 白藜芦醇对肺组织和血清中PLA2的影响

结果见表3。模型组肺组织及血清中PLA2活性均升高，与空白组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；白藜芦醇高、低剂量组均可降低哮喘小鼠肺组织及血清中PLA2活性，与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 白藜芦醇对哮喘小鼠肺组织和血清中PLA2活性的影响

组别剂量/(mg·kg-1)肺组织PLA2/U血清PLA2/U空白组-0.47±0.390.53±0.33模型组-1.85±0.41☆2.18±0.54☆白藜芦醇 高剂量组250.75±0.50*0.59±0.25* 低剂量组500.39±0.23*0.48±0.15*地塞米松组50.69±0.47*0.53±0.23*

与空白组比较：☆P<0.05； 与模型组比较：*P<0.05。

3 讨论

白藜芦醇是一种天然的具有多酚结构的植物抗毒素，主要存在于葡萄皮和子、花生、桑葚和虎杖等植物中，具有广泛的药理作用。本研究重点观察白藜芦醇对哮喘小鼠PLA2及相关介质与炎性细胞的影响。

支气管哮喘是以嗜酸性细胞为主的多种炎性细胞及相关介质共同作用于气道，而诱发的慢性炎性反应[9]。PLA2是一种作用十分复杂的炎症因子和启动脂介质合成的关键酶，在支气管哮喘发病过程中发挥着重要的作用：①介导炎性细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞及中性粒细胞等)在气道内的聚集；②催化水解细胞膜磷脂产生花生四烯酸，促使二十烷类炎性介质(白三烯及前列腺素类物质)的释放；③降解肺泡表面活性物质，使肺顺应性下降，气道阻力增加；④诱导气道高反应性[1]。本实验结果显示哮喘模型小鼠BALF中白细胞总数、EOS计数、PGE2含量和PLA2活性均显著高于空白组，显示了PLA2与炎性细胞聚集及炎性介质释放的相关性。本实验观察白藜芦醇对哮喘小鼠气道炎症的影响，并以地塞米松为阳性对照，结果显示伴随PLA2活性的降低，BALF液中白细胞总数及EOS计数这些炎性细胞亦呈降低趋势，PGE2水平下降，同时小鼠哮喘急性症状明显改善。以上结果提示，白藜芦醇可降低炎性细胞在气道内的聚集，减少炎性介质的释放，实现抗炎平喘，其作用机制可能与抑制PLA2有关。

[1] 刘春丽．磷脂酶A2与支气管哮喘[J]．国外医学：呼吸系统分册，2001，21(2)：76-78.

[2] 包海荣，刘继新，刘晓菊．白藜芦醇抗肺部疾病作用的研究进展[J]．国际呼吸杂志，2007，27(9):681-684.

[3] 何冰，陈小夏，王经韵．白藜芦醇对兔离体气管平滑肌收缩功能的影响[J]．中国中医基础医学杂志，2010，16(6)：522-523.

[4] 何冰，王经韵，郑宇翔，等．白藜芦醇抗喘活性及机制研究[J]．广东药学院学报，2012，28(4)：423-426.

[5] 罗夏炯,汪玉倩,卢佩莉,等．白藜芦醇对小鼠哮喘模型及炎症介质的影响[J]．广东药学院学报，2013,29(6)：640-642.

[6] 田代印，符州，张燕，等．一种改良型小鼠哮喘模型方法的建立及评价[J]．重庆医科大学学报，2005，30(4)：601-604.

[7] 曾南，杨旋，周祯昊，等．荆芥挥发油对哮喘模型小鼠肺组织炎症介质的影响[J]．四川生理科学杂志，2006，28(4)：154-156.

[8] 陈思锋，吴中立．体液和组织磷脂酶A2简便快速测定法[J]．第二军医大学学报，1998，10(3)：254-257.

[9] 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组．支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗及教育和管理方案)[J]．中华内科杂志，2003，42(11)：817-822．

(责任编辑：幸建华)

Effect of resveratrol on the PLA2activity and airway inflammation in asthmatic mice

WANG Jingyun1,QIU Xinming2,LUO Xiajiong2,CHEN Xiaoxia2,HE Bing2

(1.GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China; 2.CollegeofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To investigate the effect of resveratrol on the PLA2activity and airway inflammation in asthmatic mice. Methods The asthmatic model was induced by ovalbumin provocation in mice. The number of total leukocytes and eosinophils (EOS) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was counted. The PGE2content in lung tissue was measured by ultraviolet spectrophotometry. The PLA2activities of lung tissue and serum were assayed by the hydrochloric acid titration method. Results The inflammatory cells in BALF,the PGE2content and the PLA2activity in resveratrol-treated group were significantly lower than that of the model group. Conclusion Resveratrol displays a protective effect in asthmatic mice,which may be related to reduction of the inflammatory cell infiltration,the PGE2content and the PLA2activity.

resveratrol; bronchial asthma; inflammatory cell; PGE2; PLA2

2016-06-16

广东省科学技术厅省中医药科学院联合科研专项项目(粤科社字[2013]102号)

王经韵(1988—),女,药师,主要从事临床药物实验，Email:dolly_sheep8897@163.com；通信作者:何冰(1959—),女,教授,主要从事心血管药理、药物筛选及新药研究，Email:wahah5566@163.com。

R285.5

A

1006-8783(2016)05-0606-03

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016061601