稀土元素镧、铈对铁皮石斛组培苗生长影响的研究

张桂芳，闫小巧，王艳，李一凡，林颖，赖小平,2

(1.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006; 2.东莞广州中医药大学 中医药数理工程研究院，广东 东莞 523000)



天然药物化学

稀土元素镧、铈对铁皮石斛组培苗生长影响的研究

张桂芳1，闫小巧1，王艳1，李一凡1，林颖1，赖小平1,2

(1.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006; 2.东莞广州中医药大学 中医药数理工程研究院，广东 东莞 523000)

目的 探讨添加稀土元素镧、铈对铁皮石斛组培苗以及移栽后铁皮石斛苗的生长的影响，寻找能显著促进铁皮石斛生长发育的稀土元素，以获得品质优良的铁皮石斛苗。方法 以铁皮石斛小苗为外植体，通过添加不同浓度硝酸镧、硝酸铈的培养基上进行培养，并对其性状特征、生理活性、移栽后生长状况等进行统计比较研究。结果 通过90 d的培养后，添加稀土元素组别的铁皮石斛的鲜质量、根数、株高、叶绿素含量均高于空白组，分蘖数低于空白组，而且随着硝酸镧和硝酸铈浓度的增高，铁皮石斛组培苗的鲜质量、株高、根数、叶绿素含量基本呈递增的趋势，分蘖数呈递减的趋势，硝酸铈浓度为40 mg/L时，其鲜质量、根数、株高最大，分蘖数最少；铁皮石斛移栽培养30 d后，稀土元素组比空白组中的存活率和抽芽率高，硝酸铈为40 mg/L时其生长情况最佳；一定浓度的稀土元素La、Ce能增强铁皮石斛组培苗的T-SOD酶、CAT酶活性和根系活力，添加10.0～40.0 mg/L La3+，SOD酶活性和CAT酶活性均呈现先增后降的趋势；添加10.0～40.0 mg/L Ce3+，SOD酶活性逐渐增强，但CAT酶活性在Ce3+10～30.0 mg/L时逐渐增强，40.0 mg/L时又稍下降；添加10.0～40.0 mg/L La3+，根系活力呈先增后降的趋势，10～30.0 mg/L时根系活力逐渐上升，40.0 mg/L时略有下降；添加10.0～40.0 mg/L Ce3+，根系活力逐渐上升，40.0 mg/L时最高。结论 稀土元素镧、铈对铁皮石斛组培苗的生长及T-SOD酶、CAT酶活性和根系活力均有较显著的影响,本文结果为铁皮石斛组培苗的壮苗以及品质的提高提供了依据。

铁皮石斛； 稀土元素； T-SOD酶活性； CAT酶活性； 根系活力

铁皮石斛来源于兰科石斛属植物铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥茎，是传统名贵药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效[1]。铁皮石斛自然繁殖力极低，野生资源濒危。为解决其药材资源短缺问题，许多科研人员对铁皮石斛进行了组培快繁研究，在种子萌发、原球茎生长及壮苗的影响因素等方面取得了一定的进展[2-4]，主要采用植物生长调节剂、有机添加物等来促进铁皮石斛的生长发育，虽然效果明显，但仍存在组培苗出瓶前易封顶、抗逆性差等问题[5]，导致移栽后长势较差、病害较为严重。因此，有必要探讨新的组培方法和适宜的培养基配方，以解决此问题。某些稀土元素具有一定的生理活性，它对植物生根、发芽、种子萌发、叶绿素的增加和光合作用等都有一定的影响[6-9]，适当浓度稀土元素能够促进植物对养分的吸收、转化和利用等，有利于改善品质、提高产量。稀土在农业上主要作为微量元素肥料，具有促进农作物增产、增强植物抗逆性、改善农作物品质的特殊性能[10-11]，在农业领域中的应用逐渐广泛深入。

本文以野生铁皮石斛种子离体无菌萌发苗为对象，探讨不同浓度稀土元素镧(La)、铈(Ce)对铁皮石斛试管苗离体生长的影响，并从超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性等生理特性方面初步阐明内在机理，为镧(La)、铈(Ce)在铁皮石斛组织培养中的合理利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 材料

野生铁皮石斛果实采自福建省连城冠豸山，经广州中医药大学刘军民教授鉴定为铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的果实。经常规消毒后将种子接种到1/2 MS附加培养基上培养获得试管苗，在经过3个月的培养后，选择长势相近、株高为2～3 cm左右的试管苗作为供试材料。

1.2 试剂

6-苄氨基嘌呤(6-BA，上海伯奥生物科技有限公司)；α-萘乙酸(NAA，广州市齐云生物技术公司)；硝酸铈、硝酸镧(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；蔗糖(成都市科龙化工试剂厂)；琼脂粉(北京康倍斯科技有限公司)；HCl(北京化工厂)；NaOH(天津市大茂化学试剂厂)；香蕉(市售海南香蕉)；常规1/2 MS培养基药品及其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器

ZHJH-C1109B超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；JZ-100-B接种器具消毒器(上海稼丰园艺用品有限公司)；SQ810C立式压力蒸汽灭菌器(重庆雅马拓科技有限公司)；A390型紫外可见分光光度计[翱艺仪器(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 培养基及培养条件

基本培养基为1/2 MS培养基，附加6-BA 0.1 mg/L、NAA 0.2 mg/L、琼脂7 g/L、蔗糖30 g/L、3%活性炭等，并根据不同的要求添加不同浓度的硝酸镧、硝酸铈(硝酸镧用La3+表示，硝酸铈用Ce3+表示)等。每一处理均同时接种45株，且每组重复3次；90 d后每组随机抽取15株试管苗分别进行称重，记录其根数、分蘖数、株高和生长状况，并对数据进行统计分析。

培养条件：培养温度(25±2)℃，光照时间12 h/d，光照强度为1 000～1 500 lx。

2.2 叶绿素含量测定

取新鲜铁皮石斛组培苗叶片，采用丙酮法[12]测定叶绿素含量，每组随机测10株。以体积分数95%乙醇为空白对照，分别测定665、649 nm处的吸光度，并计算叶绿素含量。

2.3 生理指标测定方法

每个处理组随机选取10株进行生理指标测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定(南京建成生物工程研究所T-SOD测试盒)，过氧化氢酶(CAT)活性用钼酸铵法进行测定(南京建成生物工程研究所CAT测试盒)；根系活力(四氮唑还原强度)采用TTC法测定[13]。

2.4 数据分析

数据采用Excel和IBM SPSS22.0统计软件处理，组间差异显著性采用邓肯氏新复极差法(Duncan′s multiple range test)进行多重比较检验。

3 结果与分析

3.1 不同质量浓度稀土元素La、Ce对铁皮石斛试管苗生长的影响

不同质量浓度稀土元素La、Ce对铁皮石斛试管苗生长的影响见表1和图1～图2。结果表明，添加La3+、Ce3+试验组的铁皮石斛苗鲜质量均高于空白组，且随着La3+和Ce3+质量浓度的增高，基本呈递增趋势。La3+、Ce3+质量浓度均为40 mg/L时，鲜质量明显增加；通过比较铁皮石斛试管苗株高发现(图1～图2)，空白组与La、Ce组株高差异均有统计学意义，随着La3+、Ce3+质量浓度的增高，株高递增；La3+、Ce3+质量浓度在40 mg/L时，株高增加更为明显；稀土元素La、Ce对铁皮石斛的分蘖数也有一定的影响，空白组的铁皮石斛试管苗长势一般，分蘖数多，矮小，茎秆纤细，叶片狭小，颜色浅绿，添加La3+、Ce3+组的小苗，分蘖数较少，并随质量浓度的增加分蘖数递减，苗高且茎秆粗壮，叶片较大，颜色鲜绿；说明La、Ce在一定程度上可以抑制铁皮石斛组培苗分蘖数，从而单株小苗所获得和吸收的营养物质较多，长势更好(图1～图2)。随着La3+、Ce3+质量浓度的提高，试管苗根数基本呈递增趋势。空白组小苗的根长较短，大多为2～3 cm，根数目较少，浅绿色，较细长，容易断裂(如图1 a)。随着La3+、 Ce3+质量浓度的增加，其根数目增加，根长大多为5～6 cm，最长可达8 cm，绿色，根较粗，部分露白，有韧性，不易折断。

表1 不同质量浓度稀土元素La、Ce对铁皮石斛试管苗生长的影响

组别ρ(La3+)/(mg·L-1)ρ(Ce3+)/(mg·L-1)鲜质量/g株高增长量/cm分蘖数根数整体生长状况评价1(对照组)0031.55±0.77a2.30±0.15a7.05±0.61d1.97±0.31a+210035.04±0.98b2.84±0.10ab6.22±0.26c2.41±0.18a++320035.00±0.43b3.06±0.23ab5.63±0.20ab2.76±0.21a++430042.00±0.53c3.15±0.22b5.93±0.29bc3.25±0.26a+++540046.32±0.51d3.20±0.26b6.01±0.34bc3.05±0.31a++++601038.54±0.59e2.76±0.23ab6.34±0.39c2.71±0.33a++702041.23±0.40c3.01±0.31ab6.24±0.23c2.78±0.26a++803042.93±0.87cf3.46±0.21b5.64±0.34ab3.38±0.13ab+++904044.66±0.40df3.54±0.34ab5.31±0.45a3.50±0.36a++++

注：采用Duncan′s multiple range test 分析，同一列不同字母表示差异有统计学意义(P<0.05)。

a.0 mg/L; b.10 mg/L; c.20 mg/L; d.30 mg/L; e.40 mg/L。

a.0 mg/L; b.10 mg/L; c.20 mg/L; d.30 mg/L; e.40 mg/L。

图2 不同浓度的稀土元素Ce对铁皮石斛试管苗生长的影响
Figure 2 The effect of different concentrations of rare-earth element Ce on the growth ofDendrobiiofficinalisplantlets

3.2 不同质量浓度稀土元素La、Ce对铁皮石斛试管苗叶绿素含量的影响

不同质量浓度稀土元素La、Ce对铁皮石斛试管苗叶绿素含量的影响见表2。结果表明，La、Ce均能提高植株的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量，La3+、Ce3+浓度和叶绿素含量基本呈正相关。这与王玲等[14]报道稀土元素可提高植物体内叶绿素的含量是一致的。因此，推测稀土元素La、Ce在一定程度上影响了铁皮石斛的光合作用效率。周洁等[15]对黄花蒿植株叶面喷施镧，考察它对光合作用及青蒿素积累的影响，发现适宜浓度LaCl3(20～80 μmol/ L)可促进黄花蒿体内青蒿素积累、提高叶片净光合速率(Pn)，Pn提高可能与PSⅡ原初光能转化效率及PSⅡ潜在活性的提高有关。

通过观察及数据比较发现，La、Ce对铁皮石斛的鲜质量、根数、分蘖数、株高、叶绿素含量都有一定的影响。空白组的植株长得相对较矮小，茎枝颜色较浅，叶片较小、颜色偏向黄绿色，新出芽生长速度较慢；La、Ce组植株较粗壮，茎枝颜色较深，叶片较大、颜色浓绿，新出芽生长速度较快。La3+、Ce3+浓度均为40 mg/L时，铁皮石斛试管苗鲜质量大、苗高且茎粗壮、根系发达、叶绿素含量高，生长状况良好，且Ce促进铁皮石斛试管苗生长效果较La明显。张军刚等[16]研究指出烤烟成熟过程中鲜烟各颜色值均与各色素含量、类叶比值呈显著或极显著性相关关系，表明成熟过程中烤烟叶片颜色值与色素含量关系密切，叶片颜色值变化可以指示烟叶各色素含量的变化。本研究中铁皮石斛茎叶颜色与叶绿素含量有一定关系，与前述中添加稀土元素La、Ce提高铁皮石斛叶绿素含量的结果一致。

表2 不同浓度稀土元素La、Ce对铁皮石斛试管苗叶绿素含量的影响

组别La3+Ce3+叶绿素a叶绿素b总叶绿素1(对照)007.31±0.06a4.16±0.47a11.47±0.53a21008.81±0.05b4.41±0.46ab13.20±0.50ab32008.54±1.20abc4.48±0.78ab13.02±1.77ab43009.12±0.56abc4.95±0.60ab14.07±0.71ab54009.67±0.13c5.42±0.47b15.09±0.46b60107.65±1.10abc4.80±0.55ab12.12±1.41ab70209.10±0.38bc5.24±0.18ab14.34±0.37b80309.32±0.53abc5.16±0.22ab14.48±0.50b90409.73±0.21bc5.20±0.90ab14.93±0.71b

注：采用Duncan′s multiple range test 分析，同一列不同字母表示差异有统计学意义(P<0.05)。

3.3 不同质量浓度稀土元素La、Ce对铁皮石斛试管苗T-SOD酶活性、CAT酶活性和根系活力的影响

一定浓度的稀土元素La、Ce能增强铁皮石斛组培苗的T-SOD酶和CAT酶活性(见表3)，添加10.0～40.0 mg/L La3+，SOD酶活性和CAT酶活性均呈现先增后降的趋势，La3+为10～30.0 mg/L时SOD酶和CAT酶活性逐渐增强，40.0 mg/L时均略有下降；添加10.0～40.0 mg/L Ce3+，SOD酶活性逐渐增强，40.0 mg/L时最高，是对照组的1.87倍，但CAT酶活性在Ce3+10～30.0 mg/L时逐渐增强(最大值为对照组的1.22倍)，40.0 mg/L时又稍下降。这与张杰等[17]对于稀土元素La可以提高正常及镉胁迫初期的水稻幼苗SOD、CAT酶的活性，从而促进水稻幼苗生长的研究结果一致。

一定质量浓度的稀土元素La、Ce能提高铁皮石斛组培苗的根系活力(见表3)，添加10.0～40.0 mg/L La3+，根系活力呈现先增后降的趋势，10.0～30.0 mg/L时根系活力逐渐上升，40.0 mg/L时略有下降；添加10.0～40.0 mg/L Ce3+，根系活力逐渐上升，40.0 mg/L时最高，是对照组的1.80倍。

3.4 不同质量浓度稀土元素La、Ce对铁皮石斛试管苗移栽及生长的影响

分别选择各组生长健壮的试管苗50株，先把培养瓶的瓶盖打开，每天淋适量无菌水，置于实验室内进行7～10 d的炼苗，炼苗结束后，取出试管苗，洗净根部培养基，移栽至树皮和珍珠岩的复合基质中。置于阴凉通风处，适量浇水，60 d后统计其抽芽率和成活率，结果见表4。

通过观察及数据比较发现，添加La、Ce的石斛苗生长状况优于空白组。铁皮石斛试管苗在La、Ce组中的成活率和抽芽率均较高，空白组较低。随着La3+、Ce3+浓度的增大，其成活株数及新抽出芽数呈增加的趋势，Ce3+为40 mg/L时其生长情况最佳，且优于La3+浓度组。可见，添加一定量的稀土元素La、Ce可促进铁皮石斛试管苗和移栽苗的生长，提高了铁皮石斛苗的品质，说明具有一定的壮苗作用。稀土元素La比较常用于石斛属培养中，对植株的高度、鲜质量、叶绿素含量、芽分化、根数目均有显著作用，表现出良好的促进生长作用[18]。史东平等[19]研究表明，适当浓度La浸种具有显著促进小麦根系生长、壮苗的作用，显著提高叶片细胞抗氧化酶系统活性，缓解盐胁迫对小麦幼苗的伤害。本研究中，Ce(NO3)3对铁皮石斛的生长促进作用更优于La(NO3)3，其作用更为显著，这可为进一步开发Ce(NO3)3在铁皮石斛组织培养中的应用、提高铁皮石斛的品质提供依据。

稀土元素具有一定的生理调控特性，并对植物的生长发育和品质改善有一定的促进作用。郭淑华[20]在探讨不同浓度的稀土化合物硝酸铈对南瓜组培苗的影响中表明，稀土化合物硝酸铈对组培苗的影响具有浓度依赖性，低浓度(10.0 μg/mL)有助于组培苗的生长发育，而高浓度对组培苗有毒害作用。空白组的移栽苗种植过程中，其根部容易变成褐色，慢慢影响到全株而造成移栽苗死亡，新长出来的芽生长较缓慢。添加稀土元素组的移栽苗存活率较高，生长状况较好，很少出现根部腐烂死亡的情况。稀土对作物体内的抗氧化酶有刺激作用，影响膜保护系统中的酶活性，提高作物清除自由基的能力，增强作物对逆境的抗性和对不良生长环境的适应能力[21]。说明稀土元素对增强植物抗逆性有一定的作用。

表3 不同浓度稀土元素La、Ce对铁皮石斛试管苗SOD、CAT活性和根系活力的影响

Table 3 The effect of different concentrations of rare-earth elements La and Ce on the activity of SOD,CAT and root system ofDendrobiiofficinalisplantlets

组别ρ(La3+)/(mg·L-1)ρ(Ce3+)/(mg·L-1)SOD活性/(U·mg-1)CAT活性/(U·mg-1)四氮唑还原强度/(μg·g-1·h-1)1(对照)0015.645.3325.86210018.695.6033.66320022.406.1139.69430026.467.0751.77540023.896.6247.07601022.485.3937.11702025.395.9841.95803028.486.5146.42904029.176.3046.60

表4 铁皮石斛试管苗的移栽情况Table 4 The status of Dendrobii officinalis plantlets after transplantion

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(责任编辑：陈翔)

Effects of rare-earth elements La,Ce on test-tube seedling growth ofDendrobiumofficinaleKimura et Migo

ZHANG Guifang1，YAN Xiaoqiao1，WANG Yan1，LI Yifan1，LIN Ying1，LAI Xiaoping1,2

(1.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 2.MathematicalEngineeringAcademyofChineseMedicine,Dongguan523000,China)

Objective To investigate the effect of rare-earth elements of La and Ce on test-tube seedling and transplants growth ofDendrobiumofficinaleKimura et Migo (Dendrobiiofficinaliscaulis). Methods The seedlings were tested as the explants and cultured with different concentrations of rare-earth elements La and Ce. The characteristics,physiological activity,and growth status after transplantation were compared statistically. Results After 90 days of culturing,the fresh weight,root number,plant height content of the group adding rare-earth elements were higher than the blank group,and the tiller number was lower than the blank group. The fresh weight,root number,plant height,chlorophyll content increased with the concentration of lanthanum nitrate and cerium nitrate,but the tiller number decreased. When the concentration of cerium nitrate was 40 mg/L,the fresh weight,root number and plant height were the highest,and the tiller number was the least. After transplanting for 30 days,the survival and budding rate of the group adding rare-earth elements were superior to the blank group. Certain concentrations of La and Ce enhanced the activities of T-SOD enzyme,CAT enzyme and root activity of the plantlets. When the concentration of La3+was among 10～40 mg/L,the activity of SOD and CAT showed a trend of first increasing and then falling. When the concentration of Ce3+was among 10～40 mg/L,SOD enzyme activity increased gradually. The activity of CAT increased when the concentration of Ce3+was among 10～30.0 mg/L,and decreased slightly at 40 mg/L. When the concentration of La3+was 10～40 mg/L,the root activity first increased and then decreased,and the root activity increased gradually at La3+10～30.0 mg/L,but decreased slightly at 40 mg/L. When the concentration of Ce3+was among 10～40 mg/L,the root activity increased gradually,and the highest activity was at 40 mg/L. Conclusion Remarkable changes could be observed on the growth and the T-SOD enzyme,CAT enzyme activity and root activity by adding rare-earth elements La and Ce. It provides a way and basis to improve the seedling growth and the quality ofDendrobiiofficinalis.

DendrobiumofficinaleKimura et Migo; Rare-earth elements; T-SOD enzyme activity; CAT enzyme activity; Root activity

2016-06-29

港澳台科技合作专项项目(2014DFH30010);广东省应用型科技研发专项资金重点项目(2015B020234008)；广东省公益研究与能力建设专项项目(2014A030304059)；国家自然科学基金资助项目(81001601)；广东省优秀青年教师培养计划项目(yq2014042)；广州中医药大学“青年英才”第一批培养对象项目(QNYC20120105)

张桂芳(1980—)，女，博士，副教授，从事植物细胞工程研究，电话:020-39356380,Email:zhanggf@gzucm.edu.cn；通信作者：赖小平(1960—)，男，博士研究生导师，教授，珠江学者，Email：lxp@gzucm.edu.cn。

时间：2016-10-08 11:41

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161008.1141.002.html：

R282.1

A

1006-8783(2016)05-0559-06

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062902