大孔吸附树脂-HPLC-DAD法测定知黄汤中梓醇的含量①

刘子明

(吉林工程职业学院，吉林 四平 136001)



大孔吸附树脂-HPLC-DAD法测定知黄汤中梓醇的含量①

刘子明

(吉林工程职业学院，吉林 四平 136001)

摘要:目的:建立大孔吸附树脂-HPLC-DAD法测定知黄汤中梓醇含量的方法。方法:色谱柱为shim-pack VP-ODS C18(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)，检测波长210nm，流速1.0mL/min。结果:梓醇在0.88~8.8μg范围内线性关系良好(r=0.9996)，平均回收率为99.01%,RSD=0.3%(n=6)。结论:该方法快速、简便、准确、可靠，可用于本品的质量控制。

关键词:知黄汤；大孔吸附树脂；HPLC；地黄；梓醇

知黄汤是由生地黄、知母、大枣、干姜等11味药组成的复方制剂。具有清热解毒，疏郁散瘀的功效，临床上用于肝炎，肝硬化等疾病，疗效显著。生地黄为方中的君药，传统医学认为生地具有清热凉血、养阴生津的功效。而生地黄中的梓醇是它的主要有效成分之一[1]，有文献报道用薄层扫描法、薄层扫描-比色法测定其含量[2]，也有用HPLC测定其含量。HPLC法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高等特点。本试验建立了大孔吸附树脂-HPLC-DAD测定知黄汤中梓醇含量的方法，以便控制该制剂的内在质量，为建立该制剂质量标准提供参考。

1仪器与试药

1.1仪器

2010AHT全自动高效液相色谱仪(日本岛津)；CLASS-VP色谱工作站(日本岛津)；二极管阵列检测器(DAD)；FA1204B电子分析天平(d=0.1mg，上海精密科学仪器有限公司)；HS3120超声波清洗仪(天津先德科技仪器有限公司)。

1.2试药

知黄汤(实验室自制，批号分别为：20140103 ；20140104；20140105)；梓醇对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110808-200508)；乙腈(色谱纯，淄博迪敏德经贸有限公司)；磷酸(分析纯，北京化工厂)；二次蒸馏水(实验室自制)；D101大孔吸附树脂(天津制胶厂)。

2 方法与结果

2.1大孔吸附树脂柱制备

取50g D101大孔吸附树脂用乙醇浸泡7d，湿法装色谱柱后，用乙醇洗脱，流出液与水不产生浑浊，改用蒸馏水洗脱，备用。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的梓醇对照品4.4mg，用流动相乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)定容至10mL容量瓶中，制成每1mL含0.44mg的溶液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

精密吸取知黄汤25mL，加于大孔吸附树脂柱，然后用蒸馏水，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇进行梯度洗脱，收集20%~80%洗脱液，减压浓缩到100mL，取浓缩液1mL稀释定容至10mL量瓶，备用。精密量取稀释液1mL，置10mL容量瓶中，加流动相乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照液的制备

按处方取除去生地黄的其他各味中药按知黄汤制备工艺制成阴性对照样品，取阴性对照样品适量，按2.2.2项下方法制成阴性对照液。

2.3色谱条件与系统适应性实验

色谱柱：shim-pack VP-ODS C18(250mm×4.6mm,5μm，批号：3082427)，流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)，流速：1.0mL/min，检测波长：210nm，柱温：25℃，进样量：20μL，在此色谱条件下测定，理论塔板数按梓醇峰计算不低于5000,分离度大于1.5。

分别取对照品、供试品和阴性对照溶液注入高效液相色谱仪中进行测定。结果显示阴性对照液在梓醇相应峰位置无任何峰出现，说明该汤剂中其他成分对梓醇测定无干扰(见图1)。

A B C

图1 高效液相色谱图

注：1.梓醇峰；A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照品溶液

2.4线性关系考察

分别精密吸取梓醇对照品溶液2μL、5μL、10μL、15μL、20μL，依法测定。以峰面积积分值为纵坐标，梓醇对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为Y=226332x-115977,r=0.9996，表明，梓醇进样量在0.88~8.8μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5精密度试验

精密吸取同一浓度对照品溶液20μL，按上述色谱条件，重复进样5次，测定峰面积。结果梓醇色谱峰面积的RSD为0.61(n=5)。结果表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验

取同一批样品(批号：20140103)5份，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备，以上述色谱条件测定，记录峰面积，结果显示梓醇含量的RSD为0.60(n=5)，结果表明重复性良好。

2.7稳定性试验

取同一批样品(批号：20140103)，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件，分别于0，4，8，12，16，24h进样20μL，记录峰面积，结果梓醇峰面积的RSD为1.18(n=6)，结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.8加样回收率试验

精密吸取已知梓醇含量的知黄汤(批号为20140103)25mL，共6份，分别精密加入梓醇对照品适量，按照2.2.2项下制备，依法测定，计算回收率，结果表明，本法准确可靠。见表1。

表1　加样回收率测定结果(n=6)

2.9样品测定

取3批样品，每批3份，每份1mL，按2.2.2项下供试品溶液制备方法制备，依法测定，计算含量，见表2。

表2　样品测定结果(n=3)

3讨论

3.1该制剂由11味中药组成，因此成分复杂，干扰大，主峰与杂质峰分离效果不好，本试验采用了大孔吸附树脂进行了纯化，结果梓醇分离效果较好,主峰与杂质峰分离较好。

3.2本试验开始参照文献报道[3]，采用甲醇-0.1%磷酸溶液(1：99)为流动相，结果发现峰分离效果不好，峰形有拖尾。因此本文对流动相系统组成与比例进行比较。然后参照《中国药典》[4],采用地黄中梓醇含量测定时的流动相系统(乙腈-0.1%磷酸溶液(1：99)，结果表明，采用流动相乙腈-0.1%磷酸溶液(1：99)能使梓醇标准品峰形良好无拖尾，且与其它组分达到较好分离。

参考文献:

[1]贺玉琢，李振东.日本对地黄的研究[J].国外医学中医中药分册，1997，19(4)：13-17

[2]张玲，徐新刚.双波长薄层扫描法测定生地及熟地中梓醇的含量[J].中草药，1998，29(5)：308

[3]邱建国,张汝学,贾正平,等. HPLC法测定地黄、不同提取物及熟地黄中的梓醇[J]. 中国实验方剂学杂志,2010,(1):23-25

[4]国家药典委员会．中华人民共和国药典：一部[S]．北京：中国医药科技出版社，2010：115-116

The determination of catalpol in Zhi-huang decoction by macroporous resin and HPLC-DAD

LIUZi-ming

(Jilin Engineering Vocational College, Siping 136001,China)

Abstract:Objective: To establish an macroporous resin and HPLC-DAD method of Determination capaltol in Zhi-huang decoction. Methods: The sample was separated on a Shimadzu VP-ODS (250mm×4.6mm,5 μm) with acetonitrile -0.1% Phosphoric acid(1：99). The detection wavelength was set at 210nm. The flow rate was 1.0mL/min. Result: The calibration curve was linear over the range of 0.88~8.8μg(r=0.9996). The average recovery of the method was 99.01%. The RSD of precision of the sample was 0.3%(n=6). Conclusion: The results showed that this method was rapid, simple, accurate and reliable, and it could be used for quality control of Zhi-huang decoction.

Key words:Zhi-huang decoction; macroporous resin; HPLC; rehmannia; catalpol

(收稿日期：2015-11-09)

中图分类号:R917

文献标识码:A

文章编号：1008-0104(2016)01-0051-02

作者简介:刘子明(1979~)男,吉林公主岭人，学士，讲师，主要从事食品药品分析及质量控制研究。

基金项目：四平市科技发展计划项目，编号：2014045。.