MAPKs在丙泊酚后处理减轻大鼠缺血/再灌注损伤中作用①

王　坤,陈琪珍,杨剑波,鄂苏评

(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院麻醉科，黑龙江 哈尔滨 150081)



MAPKs在丙泊酚后处理减轻大鼠缺血/再灌注损伤中作用①

王坤,陈琪珍,杨剑波,鄂苏评

(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院麻醉科，黑龙江 哈尔滨 150081)

摘要:目的:研究丙泊酚后处理对离体大鼠缺血/再灌注心肌的影响及MAPKs信号转导通路在其中的作用。方法 ：选用SD大鼠40只，按照随机数字表法分为5组：空白对照组(Control组，n=8)、缺血/再灌注组(I/R组，n=8)、丙泊酚后处理低剂量组(Plow组，n=8)、中剂量组(Pmid组，n=8)和高剂量组(Phigh组，n=8)；采用Langendorff 离体心肌缺血再灌注法建立模型，于续灌末取下心脏，采用Tunel 法检测缺血区心肌细胞凋亡和Western blot 测定Bcl-2、Bax及MAPKs信号转导通路的蛋白表达。结果:与Control组比较，I/R组心肌细胞凋亡率(AR)显著增加(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌细胞AR显著较少(P<0.05)；与Control组比较，I/R组心肌Bcl-2表达显著降低(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌组织Bcl-2表达明显增加(P<0.05)；与Control组比较，I/R组心肌Bax表达显著增加(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌组织Bax表达显著较少(P<0.05)；与Control组比较，I/R组心肌组织p-ERK1/2表达显著降低(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌组织p-ERK1/2表达明显增加(P<0.05)；与Control组比较，I/R组心肌组织p-p38表达显著增加(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌组织p-p38表达显著较少(P<0.05)。结论：丙泊酚后处理减少离体大鼠缺血/再灌注心肌细胞的凋亡，发挥心肌保护作用，其保护机制与激活MAPKs信号转导通路(ERK1/2和p38活化)有关。

关键词:MAPKs；丙泊酚后处理；缺血/再灌注；Bcl-2；Bax

急性心肌缺血事件是临床上麻醉医生经常面临的一种病理生理改变，是围术期严重的心脏危险事件，也是围术期死亡常见原因。适时进行有效再灌注是挽救心肌最有效的方法。但再灌注也加重心肌损伤，即缺血/再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，I/R)。因此，寻找一种临床可控性强，又能切实有效的减轻再灌注损伤的防治措施已成为一项重要的基础和临床课题。在我国，静脉麻醉药丙泊酚使用较为普遍。丙泊酚属于新型非巴比妥类静脉全麻药，起效迅速，作用脑部GABA受体—氯离子复合物，发挥镇静催眠作用，效果安全可靠。目前在临床麻醉工作中应用广泛。以往研究证实，预先应用丙泊酚于缺血性心肌可以起到心肌保护作用，在离体实验中，预先应用丙泊酚灌注离体心肌，发现丙泊酚可以明显减轻缺血/再灌注心肌的水肿，发挥心肌保护作用。但有关丙泊酚后处理的心肌保护作用及该保护作用是否通过MAPKs信号转导通路，目前尚不十分清楚。因此深入研究丙泊酚后处理对心肌缺血/再灌注损伤的影响及其作用机制更具现实意义。

1材料与方法

1.1实验动物与分组

选用健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，体重(200±20)g，16～18月龄，购于北京维通利华公司实验动物中心。在温度(23±0.5)℃，湿度为40%~60%，光照与熄灯各12h环境中适应性驯养7d，操作均由固定人员在上午8：00至10：00进行实验。动物的处理符合哈尔滨医科大学实验动物管理规定和国际实验动物使用准则。

选用SD大鼠40只，按照随机数字表法分为为5组：空白对照组(Control组，n=8)，离体心脏在37°C条件下，平衡30min，正常K-H液灌流210min；缺血/再灌注组(I/R组，n=8)，离体心脏在37°C条件下，平衡30min，全心缺血30min，再灌注180min；丙泊酚后处理低剂量组(Plow组，n=8)、中剂量组(Pmid组，n=8)和高剂量组(Phigh组，n=8)，离体心脏稳定30min，全心缺血30min，丙泊酚低剂量(60umol·mL-1)、中剂量(100umol·mL-1)和高剂量(150umol·mL-1)的K-H灌注溶液处理2min，洗脱2min，连续3个循环后，再灌注168min。

1.2离体大鼠心脏灌注langendorff模型

所有大鼠禁食12h，可以自由饮水。麻醉采用20%乌来糖(腹腔注射1.0g·kg-1)，进入麻醉状态后，利多卡因1.0%腹前壁切口处局部侵润麻醉。然后仰卧位并固定四肢，备皮后消毒，再横向沿肋缘剪开腹前壁，剪开腹中线向上至剑突，向下剪至膈肌，再纵向沿两侧锁骨中线剪开胸腔，逐层分离纵膈前组织，将胸壁前组织翻向头侧，显露出心脏，轻柔取出心脏后，立即放于4℃的饱和的K-H缓冲液(用混合气体95%O2+5%CO2，1.5L·min-1饱和)中反复漂洗，冲出心脏内残余血液。使用眼科镊子提起主动脉进行插管，连接Langendorff灌注管口，逆行采用恒压灌注，保持灌注压10kPa，速度维持在7～10mL·min-1。灌注系统和心肌组织温度维持在(37±0.5)℃，室温保持在(25±1)℃。开始灌流数秒后心脏便开始跳动。1min后剪开左心耳上方，经过左心房和二尖瓣，将一头带有测压导管的心室球囊送至左心室，另一端经过压力换能装置连接到生理记录仪上。稳定后10min后，使用1mL注射器缓慢向左心室球囊内注射生理盐水(40~60μL)，然后调节左水囊容积使左心室舒张末期压力(LVEDP)保持在3~7mmHg范围内，然后维持水囊容积恒定。

选择离体心脏标准：经Langendorff模型平衡灌注15min后，离体心脏HR<200bpm，LVSP<10 kPa，室早或房早>2bpm均排除实验。

1.3指标检测

采用Tunel 法检测缺血区心肌细胞凋亡和Western blot 测定Bcl-2、Bax及MAPKs信号转导通路的蛋白表达。

1.3.1Tunel法检测心肌细胞凋亡

取同一部位心肌组织做石蜡切片，镜下选取3个高倍镜(×200)视野，分别计数凋亡细胞数和细胞总数(棕色核染色即是凋亡细胞)，以凋亡率(Apoptotic Rate，AR)作为心肌细胞凋亡指标：AR =凋亡细胞数/心肌细胞总数×100%。

1.3.2Western blot 测定心肌组织Bcl-2、Bax及MAPKs蛋白表达

取同一部位心肌组织，研磨后匀浆提取总蛋白，采用BCA方法检测蛋白质浓度。采用loading buffer进行沸水浴，5~10min经过充分变性，加各组心肌组织蛋白40μg，进行聚丙酰胺凝胶电泳，电泳条件恒流250mA。采用湿法进行转膜60 min，到PVDF膜，含5%脱脂奶粉的 TBST 溶液中进行封闭，封闭约60min，然后4℃条件下一抗(1:500)过夜，采用TBST溶液洗膜10min×3次，在37℃条件下使用辣根过氧化物酶标记的二抗(1:1 000)进行孵育90min，TBST洗膜10 min×3次，选用ECL试剂盒进行发光，最后曝光。目标蛋白(Bcl-2、Bax和total-ERK1/2、total-p38、total-JNK及p-ERK1/2、p-p38、p-JNK)条带与GADPH比值表示其相对表达量。

1.4统计学方法

采用 SPSS 13. 0 的统计学软件包进行统计学处理。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1心肌细胞凋亡率比较

与Control组比较，I/R组心肌细胞AR(5.93%)显著增加(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌细胞AR(3.11%)显著较少(P<0.05)，Plow和Phigh组心肌细胞AR(5.52%和5.24%)无明显减少，见图 1。

2.2心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达比较

与Control组比较，I/R组心肌组织Bcl-2表达显著降低(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌组织Bcl-2表达明显增加(P<0.05)，Plow组和Phigh组心肌组织Bcl-2表达无明显增加， 见图 2。

与Control组比较，I/R组心肌组织Bax表达显著增加(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌组织Bcl-2表达明显降低(P<0.05)，Plow组和Phigh组心肌组织Bax表达无明显降低， 见图 2。

图1心肌细胞凋亡率表达(×200)

图2　心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达

2.3心肌组织MAPKs信号转导通路蛋白表达比较

与Control组比较，I/R组心肌组织p-ERK1/2表达显著降低(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌组织p-ERK1/2表达明显增加(P<0.05)，Plow组和Phigh组心肌组织p-ERK1/2表达无明显增加，见图3。

与Control组比较，I/R组心肌组织p-p38表达显著增加(P<0.05)；与I/R组比较，Pmid组心肌组织p-p38表达明显降低(P<0.05)，Plow组和Phigh组心肌组织p-p38表达无明显降低，见图3。

各组间total-ERK1/2、total-p38、total-JNK及p-JNK蛋白表达无明显差异。

图3　心肌组织MAPKs信号转导通路蛋白表达

3讨论

本研究发现，中剂量丙泊酚后处理能显著减少离体大鼠缺血/再灌注心肌组织细胞凋亡，发挥心肌保护作用，该保护作用可能是通过MAPKs信号转导通路(ERK1/2和p38)活化来实现的。

缺血/再灌注损伤所致心肌细胞凋亡是心肌损伤的重要原因。Bcl-2和Bax是依赖线粒体凋亡途径中重要的一组调控基因。Bcl-2是调控细胞凋亡的重要基因，其表达蛋白位于线粒体膜或核膜及溶酶体膜，可抑制细胞凋亡[1]。Bax也属Bcl-2基因家族，但功能与Bcl-2基因相反，Bcl-2有抗凋亡功能，而Bax则有促凋亡作用[2]。Bax与Bcl-2蛋白形成异二聚体，使Bcl-2蛋白失活，从而促进细胞凋亡。Bcl-2和Bax相互作用，共同调控细胞凋亡[3,4]。本实验结果显示：I/R组抗凋亡Bcl-2表达下降，促凋亡Bax表达上调，说明缺血/再灌注损伤促进凋亡基因Bax表达，而抗凋亡基因Bcl-2表达受到抑制，从而诱导心肌细胞凋亡形成，这与心肌组织形态学检查结果表达一致。

目前丙泊酚是我们临床最常用的新型非巴比妥类的静脉全麻药，作用于脑内GABA受体—氯离子复合物，使其激活发挥镇静催眠效果，能够抑制脂质过氧化反应、改善心肌细胞线粒体膜通透性等效果[5]。以往研究证实，丙泊酚可以清除体内自由基、增加机体抗氧化水平，显著抑制心肌细胞肌纤维跨膜钙离子的内流，然后抑制心肌细胞钙超载，可以发挥一定的心肌保护效应。本研究结果显示，丙泊酚中剂量组与缺血/再灌注组比较，Bcl-2表达上调，Bax表达下调，说明丙泊酚通过增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制促凋亡蛋白Bax表达，对减轻心肌缺血/再灌注损伤，这与以往研究结果相一致。

目前有关丙泊酚后处理心肌保护作用的信号转导机制尚不十分清楚。细胞凋亡是缺血/再灌注过程中心肌细胞死亡的重要形成机制，其凋亡的发生、发展受丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路(mitogen- activated protein kinase，MAPKs)的调控。该家族主要包括：①细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases，ERK1/2)；②蛋白激酶p38(p38)；③c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)。这3条主要信号转导途径在心肌缺血/再灌注中发挥的作用不尽相同：ERK1/2在心肌缺血/再灌注时激活可以起到保护心肌细胞的作用，阻断ERK1/2通路可增加心肌细胞的凋亡[6]；而JNK和p38通路激活后可使细胞凋亡增加[7]。那么丙泊酚心肌保护效应是否与ERK1/2、 JNK和p38活化有关呢？目前有关MAPKs途径在丙泊酚心肌保护效应中作用的报道较少，且未形成统一观点。以往研究提示在心肌再灌注时激活ERK1/2途径可发挥心肌保护作用[8,9]。Sun[10]等采用乳鼠的心肌细胞缺氧/复氧模型进行实验，结果发现，缺氧后处理抑制缺氧/复氧诱导JNK和p38 MAPK磷酸化，可减少Bax和凋亡细胞数目，提示抑制JNK和p38可减轻缺氧/再灌注所致细胞凋亡。在本研究中，丙泊酚的剂量我们参照文献[10,11]选取。本实验结果显示，中剂量丙泊酚可增加心肌ERK1/2活性，降低p-38表达，说明丙泊酚可能通过ERK1/2和p-38信号转导通路减轻心肌缺血/再灌注损伤，该结果与文献[12]相似，证实丙泊酚后处理在离体大鼠心肌缺血/再灌注过程中具有心肌保护作用。

综上所述，丙泊酚对离体大鼠缺血/再灌注心肌有保护作用，可减少心肌细胞凋亡，其信号转导机制可能与ERK1/2和p38信号通路活化有关。

参考文献：

[1]Duan X, Ji B, Yu K. Acidic buffer or plus cyclosporine A postconditioning protects isolated rat hearts against ischemia-reperfusion injury[J].Perfusion,2011,26(3):245-252

[2]Loor G, Kondapalli J, Iwase H, et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion[J]. Biochim Biophys Acta,2011,1813(7):1382-1394

[3]Hochhauser E, Kivity S, Offen D, et al. Bax ablation protects against myocardial ischemia-reperfusion injury in transgenic mice[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008,284(6): 2351-2359

[4]Moe GW, Naik G, Konig A, et al. Early and persistent activation of myocardial apoptosis, bax and caspases: Insights into mechanisms of progression of heart failure[J]. Pathophysiology, 2008,(3):183-192

[5]Shao H, Li J, Zhou Y, et al. Dose-dependent protective effect of propofol against mitochondrial dysfunction in ischaemic/reperfused rat heart: role of cardiolipin[J]. Br J Pharmacol,2008,153(8):1641-1649

[6]Li DY, Tao L, Liu H, et al. Role of ERK1/2 in the anti-apoptotic and cardioprotective effects of nitric oxide after myocardial ischemia and reperfusion[J]. Apoptosis,2006,11(6):923-930

[7]Pantos C, Malliopoulou V, Paizis I, et al. Thyroid hormone and cardioprotection: study of p38 MAPK and JNKs during ischaemia and at reperfusion in isolated rat heart[J]. Mol Cell Biochem,2009, 242(1-2):173-180

[8]Yang XM, Proctor JB, Cui L, et al. Multiple, brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways[J]. J Am Coll Cardiol,2004,44(5):1103-1110

[9]Darling CE, Jiang R, Maynard M,et al. Postconditioning via stuttering reperfusion limits myocardial infarct size in rabbit hearts: role of ERK1/2[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(4):1618-1626

[10]Sun HY, Wang NP, Halkos M, et al. Postconditioning attenuates cardiomyocyte apoptosis via inhibition of JNK and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways[J]. Apoptosis,2006,11(9):1583-1593

[11]Shao H, Li J, Zhou Y. Dose-dependent protective effect of propofol against mitochondrial dysfunction in ischaemic/reperfused rat heart: role of cardiolipin[J]. Br J Pharmacol,2008,153(8): 1641-1649

[12]He W, Zhang F J, Wang S P. Postconditioning of sevoflurane and propofol is associated with mitochondrial permeability transition pore[J]. J Zhejiang Univ Sci B,2008,9(2):100-108

(收稿日期：2015-12-05)

中图分类号：R542.2

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)01-0008-03

作者简介：王坤(1979~)女，黑龙江哈尔滨人，博士，副教授，研究方向：心肌保护作用机制研究。

基金项目：黑龙江省教育厅2012年度科学技术研究(面上)计划项目，编号：12521189。