日本囊对虾Na-K-2Cl共同转运蛋白基因的克隆与组织表达分析

刘洪涛，王　军，毛　勇，乔　莹，钟声平，苏永全

(厦门大学海洋与地球学院，福建厦门361102)



日本囊对虾Na-K-2Cl共同转运蛋白基因的克隆与组织表达分析

刘洪涛，王军，毛勇，乔莹，钟声平，苏永全*

(厦门大学海洋与地球学院，福建厦门361102)

摘要:利用反转录PCR( RT－PCR)和cDNA末端快速扩增( RACE)等技术在鳃组织中获得日本囊对虾( Marsupenaeus japonicus) Na－K－2Cl共同转运蛋白( NKCC) cDNA全序列，包含14 bp的5'非编码区( 5'－UTR)、201 bp的3'－UTR和3 183 bp的开放阅读框( ORF)．该ORF共编码1 060个氨基酸，预测蛋白分子质量为117．051 ku，理论等电点为6．57，命名为Mj－NKCC．预测Mj－NKCC二级结构由10个跨膜区组成，跨膜区的氨基酸序列和布局均相对保守．同源对比结果显示，Mj－NKCC的氨基酸序列与夏威夷海蚀洞虾( Halocaridina rubra)的Na－K－2Cl共同转运蛋白相似度最高，为77%．系统进化分析表明Mj－NKCC与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹( Callinectes sapidus)等甲壳动物的NKCC聚为一支．实时荧光定量PCR( qRTPCR)分析表明，Mj-NKCC基因在肝胰腺、鳃、胃、肠、心、眼柄、肌肉和血细胞中均有表达，鳃组织中表达量最高;在盐度骤变时，该基因表达变化显著，表明其很可能参与了对虾的渗透压调节，在对虾的渗透平衡中发挥重要作用．

关键词:日本囊对虾; Na－K－2Cl共同转运蛋白( NKCC) ;基因克隆;组织表达;盐度骤变

日本囊对虾( Marsupenaeus japonicus)属甲壳纲( Crustacea)，十足目( Decapoda)，对虾科( Penaeidae)，囊对虾属( Marsupenaeus)，在我国黄海、东海和南海海域均有分布，是我国重要的经济养殖虾类［1］．日本囊对虾属海水广盐性对虾，适宜的盐度范围是15～34，但对水体盐度的变化较为敏感．陈坚等［2］研究发现低盐度对日本囊对虾生长和存活率的影响较为明显．李才文等［3］证实盐度变化能够影响对虾的免疫状况，盐度升降和偏离正常生存盐度范围均使对虾抗感染力降低，成为病毒病爆发的重要诱因．因此，研究日本囊对虾对盐度的渗透调节机制具有重要的理论意义和生产应用价值．

Na－K－2Cl共同转运蛋白( NKCC)是动物中广泛存在的一类电中性离子跨膜转运蛋白，基本上均以1Na∶1K∶2Cl的形式负责同向跨膜转运Na、K、Cl离子进出上皮细胞与非上皮细胞，在上皮细胞离子转运、细胞体积和离子浓度的维持和调节、渗透压平衡和神经内分泌调控等方面均发挥重要生理功能［4］．NKCC基因在高等脊椎动物中研究已较为深入，而无脊椎动物中研究较少．Sun等［5］研究果蝇( Drosophila melanogaster)时发现一个CG4357蛋白，其与SLC12家族的第一分支存在较高的同源性，经证实其确为NKCC的昆虫同源类似物．目前在蓝蟹( Callinectes sapidus)、岸蟹( Carcinus maenas)、张口蟹( Chasmagnathus granulata)和中华绒螯蟹( Eriocheir sinensis) 4种蟹类和1种夏威夷海蚀洞虾( Halocaridina rubra)中已获得NKCC基因序列，且其表达随盐度变化上调［6－8］，但尚未见对虾类NKCC基因的相关报道．本实验成功克隆日本囊对虾NKCC基因( Mj-NKCC) cDNA全序列，并分析其在日本囊对虾不同组织中的表达，以及在环境盐度发生骤变时的表达变化，可为研究甲壳动物离子通道与渗透调节机制积累基础资料．

1材料与方法

1. 1实验材料和试剂

实验用日本囊对虾购自福建省漳州市东山县，体长为( 10．44±0．12) cm，体质量为( 14．05±0．86) g，暂养于2．5 m×2 m×1．5 m室内水泥池中．暂养一周后，随机选取6尾身体完整无损伤的健康个体，取其肝胰腺、鳃、胃、肠、心、肌肉、眼柄和血细胞迅速置于液氮中保存备用．

RNAiso Plus总RNA提取试剂、PrimerScriptTM反转录酶、pMD19－T载体、Taq酶、TdT末端脱氧核苷酰转移酶、Ex Taq酶、dATP、PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR®Premix Dimer EraserTM均购自宝生物工程(大连)有限公司( TaKaRa) ; DNA纯化通用试剂盒、高效感受态细胞制备试剂盒购自厦门鹭隆生物有限公司;其他常用试剂耗材购自厦门太阳马生物有限公司．

表1日本囊对虾NKCC基因克隆与表达分析所用引物Tab．1 Primers used for cloning and expression analysis of Mj-NKCC gene

1. 2引物设计

以日本囊对虾转录组数据库中与NKCC基因高度相似的unigene片段作为模板，利用引物设计软件Primer Premier 5．0［9－10］和分析软件Oligo 6．0设计中间片段扩增引物，并利用克隆获得的cDNA片段分别设计cDNA 3'末端快速扩增( 3'－RACE)和5'－RACE巢式PCR引物．以日本囊对虾翻译延伸因子基因( EF1-α)作为内参基因，根据获得的Mj-NKCC全长cDNA序列设计实时荧光定量PCR( qRT－PCR)引物．所有引物(表1)均由深圳华大基因有限公司合成．

1. 3 Mj-NKCC cDNA克隆

参照RNAiso Plus说明书提取日本囊对虾鳃组织总RNA，取5 μL进行1%(质量分数，下同)琼脂糖凝胶电泳检测，并使用ND－1000超微量紫外分光光度计测定其质量分数和纯度．用于cDNA克隆的3'－RACE和5'－RACE模板参照孙田田等［11］实验方法制备．

利用5对引物扩增和验证Mj-NKCC cDNA的中间片段，PCR反应体系( 50 μL) :无菌双蒸水( DDW) 37．5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP ( 2．5 mmol/L each) 4 μL，正反向引物( 10 nmol/mL)各1 μL，Taq酶( 2．5 U/ μL) 0．5 μL，cDNA模板1 μL．PCR反应程序: 95℃5 min; 95℃45 s，55℃60 s，72℃90 s，36个循环; 72 ℃10 min．PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，将纯化产物连接至pMD19－T载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞，菌液涂布于添加氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜，挑取阳性克隆测序即获得目的片段序列．

利用3'－RACE的巢式PCR引物依次进行3'末端序列的扩增，PCR反应体系( 50 μL) : DDW 37．5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP ( 2．5 mmol/L each) 4 μL，RA引物( 20 nmol/L) 1 μL，FF1/FF2引物( 10 nmol/mL)各1 μL，Ex Taq酶( 2．5 U/μL) 0．5 μL，cDNA第一链模板/第一轮巢式PCR稀释产物1 μL．按照不同的引物设置适当的退火温度来进行扩增，第二轮巢式PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，按照上文步骤进行克隆测序，所得即为3'末端序列．

利用引物RR1、RR2和Oligo dT－RA、RA，及制备的5'－RACE模板进行5'末端序列的巢式PCR扩增，操作步骤同3'－RACE．

随着人们生活水平的提高，脑卒中偏瘫患者对后期康复和生活质量改善的需求也日益增多，虽然在住院期间患者能够享受较完善的护理服务，但出院后由于医疗条件和环境限制，其后续的护理需求难以保障。延续性护理通过对出院患者提供以人为中心的全方位整体护理，可满足偏瘫患者出院后的护理需求。

1. 4生物信息学分析

利用DNASTAR 5．0软件对所得片段进行拼接和重叠序列的去除，确定开放阅读框( ORF)区域并推导出相应氨基酸序列［12］．利用GenBank中BLAST工具( http:∥blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi)对所得的cDNA序列与核酸数据库及蛋白质数据库进行同源比对分析［13］．利用ClustalX软件对核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对分析［14］．利用ProtParam程序( http:∥web．expasy．org/protparam/)统计氨基酸含量、预测理论分子质量和等电点．利用在线分析软件SignalP 4．1 Server ( http:∥www．cbs．dtu．dk/services/ SignalP/)进行信号肽分析［15］．利用SMART ( http:∥smart．embl－heidelberg．de/)进行蛋白功能结构域分析．利用PSIPRED( http:∥bioinf．cs．ucl．ac．uk/psipred/)和PredictProtein( http:∥www．predictprotein．org/)分析蛋白质二级结构及活性调控位点．利用MEGA 6．06软件的邻接法( neighbor－joining，NJ)构建系统发育树，分支置信度采用自展法( bootstrap analysis，BP)重复检验1 000次［16］．

1. 5 Mj-NKCC mRNA表达的组织分布检测

按照上文1．3小节中实验步骤提取日本囊对虾肝胰腺、鳃、胃、肠、眼柄、心、肌肉、血细胞8种组织总RNA，并根据RNA总浓度添加适量的模板，按照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书制备cDNA模板．

qRT－PCR按照SYBR®Premix Dimer EraserTM说明书配制反应体系，在ABI公司的7500快速实时荧光定量PCR系统上进行，每个样品的目的基因和内参基因分别重复3次，同时设置未添加cDNA模板的阴性对照，PCR反应体系( 20 μL) : SYBR®Premix Dimer EraserTM( 2×) 10 μL，引物( 10 μmol/L)各0．6 μL，ROX Reference DyeⅡ( 50×) 0．4 μL，cDNA模板2 μL，DDW 6．4 μL．反应程序采用三步法: 95℃预变性30 s; 95℃3 s，60℃30 s，72℃30 s，40个循环，采集荧光信号; 60～95℃获得熔解曲线．采用2－ΔΔCT法［17］用Excel 2013软件分析表达数据，用Origin7．0软件展示检测结果．

1. 6 Mj-NKCC mRNA在盐度骤变时表达变化的检测

随机选取100尾实验对虾于盐度为25的水泥硬池中暂养2周，其他条件同1．1．将实验对虾平均分为2组，分别迅速转移至盐度为15和35的水泥池中，于0，3，6，12，24，48，72，96 h随机选取5尾实验对虾，冰上解剖取鳃组织迅速置于液氮中保存备用．qRT－PCR实验的设计和数据分析参照1．5小节．

2结　　果

将测序结果进行比对拼接获得日本囊对虾NKCC 的cDNA全序列( GenBank: KR063275)，命名为Mj-NKCC，其全长为3 398 bp(图1)．Mj-NKCC的cDNA包括5'非编码区( 5'－UTR) 14 bp，3'－UTR 201 bp，ORF 3 183 bp; 3'－UTR包含典型的加尾信号序列( AATAAA)和13 bp的poly( A)序列．

Mj-NKCC的ORF共编码1 060个氨基酸(图1)，包含有92个强碱性氨基酸( Arg和Lys)和95个强酸性氨基酸( Asp和Glu)．ProtParam预测显示: Mj－NKCC蛋白分子质量为117．051 ku，等电点为6．57;预测GRAVY值为0．091，表明该蛋白为疏水蛋白;不稳定指数(Ⅱ)为36．90，显示该蛋白是稳定存在的;脂肪族指数为98．70，表明该蛋白具有较高的耐热性．Mj－NKCC存在多种功能位点，包括13个糖基化位点、3个c A M P / c G M P依赖蛋白激酶磷酸化位点、9个蛋白激酶C磷酸化位点、1 8个酪蛋白激酶C KⅡ磷酸化位点、1 6个豆蔻酰化位点和1个亮氨酸拉链基序．

图1 Mj-NKCC的cDNA全长序列及推导的氨基酸序列Fig．1 The complete Mj-NKCC cDNA sequence and deduced amino acid sequence

利用SignalP4．1预测显示Mj－NKCC蛋白的N端不存在信号肽，为非分泌蛋白．利用PSIPRED分析该蛋白的二级结构显示其中α螺旋占43．30%，β折叠占10．19%，无规则卷曲结构占45．51%．利用Predict－Protein预测该蛋白亚细胞定位为细胞膜，可信度为76%．它具有10个跨膜区，分布在氨基酸序列的第123 ～583号残基之间(图1)，除第2，9，10个跨膜区为21，25，25个氨基酸残基外，其他跨膜区均为18个氨基酸残基，大片段的蛋白N末端和C末端均位于膜内侧．膜外序列在第5和第6个跨膜区之间存在1个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点．

利用SMART分析发现该蛋白第120～634位氨基酸残基之间有一个典型的Na－K－2Cl共同转运蛋白AA _permease/SLC12A结构域．

2. 2 Mj-NKCC多重比对及系统进化树分析

由Mj-NKCC cDNA序列推导的氨基酸序列与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹等近缘物种的NKCC多重序列比对结果(图2)表明，其蛋白跨膜区及布局相对保守，C端序列也相对保守，暗示这些片段对蛋白功能可能发挥重要作用．利用BLAST同源比对分析也发现，Mj－NKCC与其他物种的NKCC具有较高的同源性，其中与夏威夷海蚀洞虾的NKCC相似度最高，为77%．系统进化树(图3)显示Mj－NKCC(图中▲标示)首先与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹、岸蟹等节肢动物的NKCC聚为一支，再与长牡蛎( Crassostrea gigas)等软体动物的聚在一起并相对脊椎动物独立分支．

2. 3 Mj-NKCC mRNA的组织表达分析

qRT－PCR检测Mj-NKCC mRNA在日本囊对虾肝胰腺、鳃、胃、肠、心、肌肉、眼柄和血细胞8种组织中的表达，结果(图4)显示在8种组织中均有表达，以肝胰腺中表达量为对照，鳃中表达量最高，其后依次为血细胞、肠、胃、眼柄、心和肝胰腺，在肌肉中的表达量最低．

2. 4 Mj-NKCC mRNA在环境盐度骤变时的表达变化

qRT－PCR检测Mj-NKCC mRNA在日本囊对虾应对环境盐度发生骤变时的表达变化，结果见图5．盐度由25骤降至15后3 h，Mj-NKCC mRNA相比0 h(对照组)显著上调表达，约为其2．8倍，6 h和12 h时均维持在与3 h相当的表达量;至24 h时，表达量进一步上调，相比0 h差异极显著( p＜0．01)，约为其8．4倍;后虽有下调，但与0 h差异仍极显著( p＜0．01) ;而在盐度由25骤升至35后，Mj-NKCC mRNA表达量虽出现波动变化，但除72 h时的表达量相比0 h表现出显著上调外( p＜0．05)，其他时间点的表达量与0 h差异均不显著．

3讨论

NKCC属于电中性的阳离子－氯转运家族( CCCs)，目前的研究表明该家族包括9种转运子，分别为1个Na/Cl共转运子、4个K/Cl共转运子、2个Na/K/Cl共转运子和2个尚不清楚功能的新发现的膜蛋白［18－19］．本实验利用RT－PCR和RACE等技术，成功获得日本囊对虾NKCC基因( Mj-NKCC)的全长cDNA序列．NKCC为一类跨膜糖蛋白，分子质量为120～200 ku，Mj－NKCC经生物信息学预测定位在细胞膜上，氨基酸序列中含有13个N－糖基化位点，在胞内和胞外区域均有分布，与Reshkin等［20］在兔腮腺中的研究发现基本一致．同源分析表明Mj－NKCC与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹、果蝇等的NKCC同源性很高，其中与夏威夷海蚀洞虾的NKCC相似度最高，为77%，说明NKCC在不同物种间较为保守．进一步系统进化分析显示Mj－NKCC首先与甲壳动物NKCC聚为一个分支，后与果蝇等节肢动物和长牡蛎、玻璃海鞘等软体动物的NKCC共同聚为一个大的分支，与高等脊椎动物明显分开，表明借助NKCC的氨基酸序列对物种进行的分子进化研究与传统的生物学分类基本吻合．

研究表明，NKCC蛋白功能的激活或抑制与该蛋白的磷酸化状态息息相关．其活化后会促使其易位到胞膜上执行功能［21］．Darman等［22］研究了NKCC的N端磷酸化状态对其蛋白的活性调控的影响，发现其末端存在多个磷酸化位点，可以与蛋白磷酸酶的SPAK、RVXF区域结合从而调控NKCC的活性;并发现Thr189的磷酸化对于HEK－293细胞表达的鲨鱼( Squalus acanthias) NKCC蛋白的活性是必要条件，而Thr184和Thr202的磷酸化则起调控作用．Flatman等［23］在关于磷酸化和蛋白间相互作用对NKCC活性调控的研究中证实，NKCC中也存在蛋白激酶A、蛋白激酶C、酪蛋白激酶CKⅡ的结合位点．Diecke等［24］的研究还证实MAPKs、CaMKⅡ以及cAMP/cGMP－PK均可以使NKCC磷酸化．Mj－NKCC的氨基酸序列含有3 个cAMP/cGMP依赖型蛋白激酶磷酸化位点、9个蛋白激酶C磷酸化位点、18个酪蛋白激酶CKⅡ磷酸化位点、膜外序列在第5和第6个跨膜区之间有1个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点．因此Mj－NKCC磷酸化/去磷酸化状态的调控，可能对其在日本囊对虾渗透压维持和调节、神经内分泌调控以及细胞周期等方面产生重要影响．

图2 Mj－NKCC氨基酸序列的多重比对Fig．2 Amino acid sequences of Mj－NKCC aligned with the NKCC sequences from other species

CCCs家族中NKCC与其他转运子在不同的物种间存在25%～67%的相似度，但二级结构均较为相似，跨膜区为8～12个疏水性氨基酸构成的螺旋，膜内区由亲水性的N端和C端组成［25］．Mj－NKCC包含10个跨膜区，N端和C端均在细胞膜内．NKCC跨膜区的氨基酸组成和分布均相对保守，研究发现其N端序列相差较大但C端序列相对保守，不同物种间拥有65%的相同氨基酸组成［26］．Mj－NKCC与蓝蟹、果蝇等的NKCC多重对比分析表明其跨膜区和C端序列均较为保守，N端序列不同物种间差异较大．跨膜区序列分析发现Mj－NKCC与其他物种相比第2，9，10个跨膜区长度变异较大，第2，4，5，6，7个跨膜区氨基酸差异较大，提示其可能与物种特异性有关．

Isenring等［27］通过构建鲨鱼与人的NKCC嵌合体进行点突变实验，发现NKCC基因的离子结合与转运及bumetanide抑制结合的能力，都依赖相对保守的疏水跨膜结构．该跨膜结构在不同亚型乃至不同物种间都是非常保守的［28］．各跨膜区的离子动力学特性不同，可能具有物种特异性，其中第2个跨膜区的氨基酸突变会影响对Na、K等阳离子的亲和力，而第4～7个跨膜区的氨基酸组成则对Cl离子的亲和力起决定作用［29］．Mj－NKCC具有与CCCs家族NKCC高度同源的AA_permease/SLC12A结构域，且该结构域定位于跨膜区，并且根据上文分析Mj－NKCC第2，4，5，6，7个跨膜区序列与其他物种差异较大，推测这些跨膜区的氨基酸变异是日本囊对虾广盐性适应的重要原因．Mj－NKCC各跨膜区的具体功能尚需进一步研究．

图3基于NKCC氨基酸序列构建的NJ系统进化树Fig．3 The neighbor－joining( NJ) phylogenetic tree constructed based on NKCC amino acid sequences

图4 Mj-NKCC mRNA的组织表达分布Fig．4 Expression of Mj-NKCC mRNA in different tissues

海产甲壳动物，其对盐度的适应能力主要体现在对渗透压和离子浓度的调节能力上，而这种调节主要由鳃来完成．鳃的上皮含有颗粒细胞、肾原细胞、柱形细胞等多种细胞类型，从而调控和维持外界水环境与血淋巴的渗透平衡，执行呼吸、排泄、渗透压调节甚至病害防御等功能，而位于这些细胞基底侧质膜的NKCC的协同转运将发挥重要作用［27－28，30－31］．利用qRT－PCR技术检测NKCC基因在日本囊对虾的鳃、肝胰腺、肠、血细胞、胃、心、眼柄和肌肉8种组织中的相对表达量，发现Mj-NKCC mRNA在这些组织中均有表达，在鳃中表达量最高．进一步的盐度骤变实验表明，Mj-NKCC mRNA在盐度发生骤变时表达量出现明显变化，在盐度骤升后72 h和骤降后3～12 h表达量变化差异达到显著水平，在盐度骤降后24～96 h表达量变化差异达到极显著水平，说明Mj-NKCC基因很可能参与了日本囊对虾的渗透压调节过程．有研究报告对夏威夷海蚀洞虾多种渗透相关基因进行研究，发现NKCC除盐度由32骤降至2时显著地上调表达外，其他盐度骤变的实验组表达波动均不显著，这可能与物种及环境不同有关，相比而言夏威夷海蚀洞虾的环境盐度变化更为剧烈与频繁［8］．综上所述，可以推测Mj-NKCC基因在日本囊对虾鳃的离子转运和渗透平衡中发挥重要作用．

图5 Mj-NKCC mRNA在环境盐度骤变时的表达Fig．5 Expression of Mj-NKCC mRNA after the salinity changes in environment

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Molecular Cloning and Expression Analysis of Na-K-2Cl Cotransporter from Marsupenaeus japonicus

LIU Hongtao，WANG Jun，MAO Yong，QIAO Ying，ZHONG Shengping，SU Yongquan*

( College of Ocean and Earth Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China)

Abstract:Na－K－2Cl cotransporter gene ( Mj-NKCC) from Marsupenaeus japonicus was obtained using reverse transcription PCR( RT－PCR) and rapid amplication of cDNA ends ( RACE) in this study．Results show that the full－length cDNA sequence of Mj-NKCC consists of a 14－bp 5' untranslated regions ( 5'－UTR)，a 201－bp 3'－UTR and a 3 183－bp open reading frame ( ORF)．The deduced amino acids sequence is composed of 1 060 amino acids，with molecular weight of 117．051 ku and isoelectric point of 6．57．The predicted second structure of Mj－NKCC contains 10 transmembrane domains，which are highly conserved in sequences and localization sites compared to other species．Multiple alignments of the amino acid sequences show that Mj－NKCC has the highest homology with Callinectes sapidus ( up to 77%)，and the phylogenetic analysis indicated that it was first clustered together with C．sapidus and Carcinus maenas．Additionally，the quantitative real－time PCR ( qRTPCR) results displayed that Mj-NKCC was expressed in hepatopancreas，gills，stomach，muscle，heart，eyestalk，intestine and hemocytes，with the highest expression level in gills．As the salinity changed sharply，significant changes occurred in the expression of Mj-NKCC，indicating that Mj-NKCC putatively participates in osmotic balance of shrimps and plays an important role in osmoregulation of shrimps．

Key words:Marsupenaeus japonicus; Na－K－2Cl cotransporter ( NKCC) ; molecular cloning; tissue expression; salinity change

*通信作者:yqsu@ xmu．edu．cn

基金项目:国家高技术研究发展计划( 863计划) ( 2012AA10A409) ;国家星火计划( 2015GA720002) ;国家虾产业技术体系岗位专家项目( CARS－47) ;福建省科技厅区域重大项目( 2013N3004) ;厦门市南方海洋中心项目( 14CZY033HJ07)

收稿日期:2015－05－07录用日期: 2015－09－16

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．009

中图分类号:Q 785; S 917．4

文献标志码:A

文章编号:0438－0479( 2016) 01－0046－09

引文格式:刘洪涛，王军，毛勇，等．日本囊对虾Na－K－2Cl共同转运蛋白基因的克隆与组织表达分析［J］．厦门大学学报(自然科学版)，2016，55( 1) : 46－54．

Citation: LIU H T，WANG J，MAO Y，et al．Molecular cloning and expression analysis of Na－K－2Cl cotransporter from Marsupenaeus japonicus［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 46－54．( in Chinese)