黄芪多糖介导NRG-1/ErbB信号通路对糖尿病心肌细胞凋亡的作用*

常 晓，李惠林，楚淑芳，刘德亮，董彦敏

(1．广州中医药大学深圳临床医学院，深圳 518003;2．深圳市中医院，深圳 518003)

黄芪多糖介导NRG-1/ErbB信号通路对糖尿病心肌细胞凋亡的作用*

常 晓1，李惠林2△，楚淑芳1，刘德亮2，董彦敏2

(1．广州中医药大学深圳临床医学院，深圳 518003;2．深圳市中医院，深圳 518003)

目的:从NRG-1/ErbB信号通路探讨黄芪多糖对糖尿病心肌病大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法:雄性SD大鼠给予高糖高脂饮食4周后用负荷小剂量的STZ诱导糖尿病大鼠模型，另设正常组。将造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、黄芪低剂量组、黄芪高剂量组和二甲双胍组。黄芪低剂量组和高剂量组分别给予400 mg·kg－1·d－1、800 mg·kg－1·d－1处理，二甲双胍组给予160 mg·kg－1·d－1处理，给药结束后分别测定空腹血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇含量，并进行超声心动图检测、心肌组织HE染色和TUNEL染色分析及Western blot分析ErbB2、AKT、Bax、Bcl-2表达水平。结果:与对照组比较，模型组空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯含量明显升高，血胰岛素水平显著降低，心肌功能受损，心肌细胞排列紊乱，细胞肥大变形，细胞核深染，间质纤维化明显，心肌组织凋亡增加。ErbB2、AKT、Bcl-2表达显著降低，Bax表达显著增加;与模型组比较，黄芪高剂量组和二甲双胍组空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯含量显著降低，血胰岛素水平显著升高，心肌功能一定程度上得以恢复，肌细胞肥大变形有所改善，间质纤维化得到明显改善，心肌组织凋亡也显著降低。ErbB2、AKT、Bcl-2表达显著增加，Bax表达显著降低。结论:高剂量组的黄芪多糖可减轻糖尿病心肌病大鼠的血糖、胆固醇及甘油三酯，减少心肌细胞凋亡，改善心功能，其作用机制可能与NRG-1/ ErbB信号通路有关。

黄芪多糖;糖尿病心肌病;NRG-1/ErbB信号通路;心肌细胞凋亡

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病所引起的一种心血管并发症，是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一［1］。糖尿病心肌病早期症状不典型，往往以心衰为首诊症状，因此早期诊断及治疗糖尿病心肌病对预后至关重要。目前西药尚无明确有效的治疗措施，因此寻找中药治疗糖尿病心肌病的治疗靶点具有重要的临床意义。

我们的前期临床研究表明，含有黄芪的中药能一定程度上改善对糖尿病心肌病患者的临床症状，改善患者左心室舒张及收缩功能［2］，但其具体的作用机制尚不清楚。因此本研究通过诱导大鼠糖尿病心肌病模型，针对NRG-1/ErbB信号通路，探讨黄芪多糖改善糖尿病心肌病心肌凋亡的分子机制，从而为糖尿病心肌病的治疗及临床新药研究和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级成年SD雄性大鼠60只，体质量180～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供(动物许可证号201505074432)。

1.2 主要试剂与仪器

黄芪多糖(天津赛诺制药有限公司，国药准字Z20040086)质量分数为98%;二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，批号1516578);Leica5001石蜡切片机(德国莱卡);Image-Pro PlusM IS2000图像分析系统(美国Media Cybernetics公司);G6805-Ⅱ型电针治疗仪(上海医用电子仪器厂);XSP-2C光学显微镜(上海光学仪器厂);HC-3018R高速冷冻离心机(安徽科大创新股份有限公司);ABI 9700 PCR仪(美国ABI公司);Thermo Multiskan Mk3酶标仪(美国Thermo公司)。

1.3 分组与干预

取正常SD大鼠60只，按随机数字表法分为对照组、模型组、黄芪低剂量组、黄芪低剂量组、二甲双胍组5组各12只。

造模方法:60只SD大鼠除对照组给予普通饲料喂养外，其余组高热量饲料4周后腹腔注射STZ (30 mg/kg)，STZ溶于pH 4.4、0.1 M枸橼酸缓冲液中，对照组给予相应体积的枸橼酸缓冲液。1周后将空腹血糖＜7.8 mmol/L的大鼠标记后，第2次注射STZ(30 mg/kg)，除正常组外继续高热量饲料喂养4周，禁食12 h，以空腹血糖≥7.8 mmol/L认为糖尿病模型成功。

将造模成功大鼠按随机数字表法分为黄芪高剂量组、黄芪低剂量组、二甲双胍组和模型组。黄芪高剂量组给予800 mg·kg－1·d－1黄芪多糖处理，黄芪低剂量组给予400 mg·kg－1·d－1黄芪多糖处理;二甲双胍组给予160 mg·kg－1·d－1处理，正常对照组、DC模型组灌胃相同体积0.5%CMC-Na溶液。给药8周，给药期间正常对照组喂饲普通饲料，其余各组给予高热量饲料，自由饮水，直至实验结束。

将式(4)傅立叶展开,可得一次谐波和二次谐波的系数分别为:If=Ioη;I2f=-kαoCLIo,可见一次谐波中含有光强信息,二次谐波中则含有气体浓度信息。令二次谐波和一次谐波的比值则m值既包括了气体浓度信息,同时消除了半导体激光器初始光强的影响[1-3]。因此本文重点为求取光源通过被测气体后的二次谐波和一次谐波强度的比值,并将此比值与标准仪器测量的气体浓度进行标教比对,确定甲烷气体浓度的计算公式。

1.4 空腹血糖、胰岛素、总胆固醇及甘油三酯测定

实验给药结束后大鼠禁食12～16 h，断尾取血，3500×g离心取血清，过氧化物酶法测量血清中葡萄糖水平，同时检测血清中甘油三酯和总胆固醇含量。按照甘油三酯试剂盒说明书方法测定血清中甘油三酯含量，测定波长为520 nm。按照总胆固醇测定试剂盒说明书测定血清中总胆固醇含量，测定波长500 nm。

1.5 超声心动图检测心功能

大鼠用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，麻醉后胸部和四肢剃毛连接Ⅱ导联心电图，应用小动物超声检测仪进行心脏心率(HR)、收缩期室间隔厚度(IVSs)、射血分数(EF%)、短轴缩短率(FS%)、左心室舒张末期内径(LVDD)、左心室收缩末期内径(LVDS)、舒张期左室后壁厚度(LVPWD)检测。

1.6 HE染色

动物采血处死后迅速将心脏取出，将心肌切成2～3 mm薄片后，取心肌同一部分置入10%甲醛溶液固定，0.01 mol/L PBS浸泡过夜，常规梯度酒精脱水包埋，制成4 mm石蜡切片。经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，苏木素-伊红(HE)染色，之后再进行梯度乙醇、二甲苯脱水。最后滴加中性树脂封片，显微镜下观察、拍照。

1.7 心肌凋亡细胞检测

TUNEL法检测各处理组心肌细胞凋亡情况:给药结束后，各组心肌组织石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化;0.5%蛋白酶K 37℃温箱消化30 min;将末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)及地高辛标记的脱氧核糖核酸(DIG-dUTP)混合液覆盖组织，37℃温箱孵育2 h;抗地高辛抗体，37℃温箱孵育30 min;DAB显色，10%甘油封片，倒置显微镜下被TUNEL染色标记的阳性细胞核呈棕黄色。半定量分析，每组随机抽取5张切片，400倍高倍视野下用标准的10×10目镜方格测视系统计数6个视野TUNEL阳性细胞核数目，并取与各视野细胞总数的比值，然后取其均值。

1.8 Western blot法检测心肌组织中p-ErbB2、p-AKT、Bax、BCL-2蛋白水平

给药结束后，利用组织裂解液裂解心肌组织，然后进行组织蛋白定量;取25 μg蛋白加入上样缓冲液，沸水浴5 min后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜;电转结束后，TBS溶液(含5%脱脂奶粉)4℃封闭过夜;封闭结束后，将PVDF膜转移至含目的抗体的TBS溶液，室温2 h;1×TBST洗膜5 min×5次，加入二抗溶液，室温孵育1 h;1×TBST洗膜5 min×5次，ECL试剂盒曝光并显影。扫描显影条带，采用Phoretix 2D软件进行灰度值分析，以同一样品的BDNF、Bax和Bcl-2与GAPDH条带的灰度值比值作为p-ErbB2、p-AKT、Bax和Bcl-2蛋白的相对含量。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 黄芪多糖对DCM大鼠空腹血糖和血胰岛素的影响

给药结束后，对各处理组的大鼠进行了空腹血糖含量测定。表2显示，模型组中大鼠空腹血糖含量与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，说明造模成功;黄芪高剂量组和二甲双胍组处理后，使得空腹血糖的含量降低，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05);但黄芪低剂量处理组降血糖效果并不明显，与模型组比较差异无统计学意义。

同时，我们也测定了各个分组中大鼠血胰岛素的含量变化。表2显示，模型组中大鼠的血胰岛素含量与对照组比较，出现了显著降低的趋势(P＜0.05);而黄芪高剂量组和二甲双胍组中大鼠的血胰岛素和模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，其含量均接近与对照组水平，但黄芪低剂量组效果不显著，与模型组比较差异无统计学意义。

2.2 黄芪多糖对DCM大鼠总胆固醇和甘油三酯的影响

为探讨黄芪多糖对DCM大鼠血脂的影响，在给药结束后，我们对各处理组的大鼠测定了其总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量。图1显示，模型组中大鼠总胆固醇和甘油三酯的含量与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);黄芪高剂量组和二甲双胍组处理后，总胆固醇和甘油三酯的含量降低，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05);黄芪低剂量处理组与模型组比较，总胆固醇和甘油三酯含量虽有降低但差异无统计学意义。

表2 黄芪多糖处理对大鼠空腹血糖和血胰岛素含量的影响

2.3 黄芪多糖对DCM大鼠心功能的影响

表3显示，为证实黄芪多糖对DCM大鼠心功能具有保护作用，在给药结束后对各处理组大鼠心功能进行了超声检测。结果显示，模型组16周时LVDD、LVDS增大、LVEF下降，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，进一步提示糖尿病心肌病模型制备成功。黄芪高剂量组和二甲双胍组LVDD、LVDS、LVEF等与模型组16周比较，收缩末期内径及舒张末期内径均减少，射血分数增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3 黄芪多糖对DCM 大鼠心功能的影响

图1 黄芪多糖处理对大鼠总胆固醇和甘油三酯的影响

2.4 黄芪多糖对DCM大鼠心肌组织的影响

为进一步证实黄芪多糖对DCM大鼠心肌组织具有保护作用，在给药结束后我们首先进行了HE染色分析。图2显示，对照组心肌细胞排列紧密且整齐，细胞核经过染色清晰可见;模型组心肌细胞排列紊乱，细胞肥大且变形，细胞核染色较深，间质明显纤维化，有炎性细胞浸润;黄芪高剂量组和二甲双胍组心肌细胞排列稍乱，细胞形态对照组比较大体相同，核染色比较清晰。

图2 黄芪多糖对DCM大鼠心肌组织HE的影响

图3 黄芪多糖对DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响

其次，我们采用TUNEL法对各组大鼠的心肌细胞进行了染色分析。图3显示，模型组中TUNEL染色阳性细胞数目与对照组比较显著增加(P＜0.05);黄芪低剂量组与模型组比较差异无统计学意义;相反，黄芪高剂量组和二甲双胍组与模型组比较，阳性染色细胞数目出现了下降趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 黄芪多糖对DCM大鼠心肌组织ErbB2、AKT、Bax、Bcl-2的影响

图5显示，Western blot检测各组p-ErbB2、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白表达水平，模型组中p-ErbB2、p-AKT和Bcl-2蛋白表达水平呈下降趋势，而Bax蛋白表达呈上升趋势，与对照组比较差异有统计学意义;黄芪高剂量组和二甲双胍组处理后，其 p-ErbB2、p-AKT和Bcl-2表达与模型组比较显著增加，Bax表达显著降低，差异有统计学意义;但黄芪低剂量处理组效果与模型组比较效果不明显，差异无统计学意义。

图4 Western blot检测p-ErbB2、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白表达水平

3 讨论

糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成为世界范围的严重危害人们健康的疾病［3］。糖尿病的根本危害在于其各种慢性并发症(心、脑、肾和血管)，这些并发症不仅严重危害人类的健康和生命，而且以其昂贵的医药费用给患者带来沉重的经济负担［4］。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)发生在糖尿病的基础上，是由于代谢紊乱及微血管病变引发的心肌广泛性坏死和心肌纤维化，早期通常表现为心肌顺应性降低、舒张功能不全，晚期以收缩功能不全为主，易发生充血性心力衰竭［5］。目前针对糖尿病心肌病尚未有特异性的治疗方法，如何减少心肌细胞凋亡、改善心肌纤维化，是现阶段预防和治疗糖尿病心肌病的主要靶点和手段［6］。

神经调节蛋白-1(NGR1)是一种跨膜蛋白，具有保护性的生长因子，因其首先在神经科学领域发现而命名［7］。NRG1可以调控上皮细胞、神经胶质细胞、神经元及心肌细胞的生长发育。NRG1-ErbB信号系统在维持心功能中发挥着重要作用。在正常心肌中，只有ErB2、ErB4可与NRG-1结合，与心肌细胞膜上的受体复合物结合后，触发胞内具有转录激活功能的蛋白质信号分子活化，活化后的转录因子进入细胞核与特定的靶基因结合，诱导晚期基因表达，从而产生各种生理功能［8］。NRG1-ErbB信号通路与心肌梗死、心力衰竭等疾病密切相关［9］。研究发现，神经调节蛋白通过多个下游通路抑制心肌细胞凋亡，促进细胞增殖和血管再生、改善心肌纤维化等作用［10］。PI3K/Akt信号通路是 NRG-1/ ErbB2/ErbB4的重要下游信号通路，在心肌组织中NRG-1通过结合ErbB4受体，再与ErbB2受体形成异源二聚体，使得受体C-末端上特定的酪氨酸残基被磷酸化，激活PI3K并产生一系列的细胞反应［11］。AKT的活化可以减少线粒体ROS的生成，从而起到抑制由其所激活的线粒体凋亡通路。Xiao等使用重组人神经调节蛋白1注入到大鼠的梗死心肌中，结果发现hNRG-1的高表达可以激活PI3K/AKT通路，增加Akt的磷酸化作用，使缺血心肌的微血管数量增加，减少细胞凋亡［12］。

Bcl-2与Bax是公认的与线粒体凋亡密切相关的调控蛋白，Bcl-2位于线粒体膜，主要功能是促进细胞生存，抑制细胞凋亡［13］;Bax位于胞质中，当高表达时可从胞质转位至线粒体膜，与Bcl-2结合形成异二聚体使之灭活，从而改变线粒体膜的通透性，引起线粒体损伤，促进细胞凋亡［14］。有研究证实，ErbB2受体抑制或失活导致凋亡基因bax表达的上调和抗凋亡基因bcl-2的表达下调，引起线粒体完整性破坏、功能受损及能量产生障碍，导致心肌细胞的凋亡［15］。

黄芪具有“益气健脾，生津止渴”的功效，黄芪多糖(astraglaus polysaccharide，APS)是从黄芪中提取出来的主要药理成分之一，具有抗应激、抗氧化、抗炎等诸多药理学作用［16］。研究证实，APS具有降低血糖和保护血管内皮细胞、抑制微血管病变的作用［17］，但其作用机制一直不清楚。本研究发现，高剂量的黄芪多糖处理不仅可以改善糖尿病大鼠的血糖、血脂，而且可以明显改善大鼠心功能，并通过上调DCM大鼠心肌组织ErbB2、AKT、Bcl-2的表达，降低Bax的表达，减少心肌细胞的凋亡。因此本研究初步证实，黄芪多糖可能通过干预 NRG-1/ErbB/ PI3K/Akt信号通路，从而降低糖尿病心肌细胞凋亡，发挥对糖尿病心肌病大鼠的防治作用。

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Astragalus polysaccharide reduces myocardial tissue apoptosis through NRG-1/ErbB signal pathway in rats

CHANG Xiao1，LI Hui-lin2△，CHU Shu-fang1，LIU De-liang2，DONG Yan-min2
(1．Shenzhen Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Shenzhen Guangdong，518033，China; 2．Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong，Shenzhen，518033，China)

Objective:To examine the potential effect of Astragalus polysaccharide(APS)on diabetic cardiomyopathy in rats．Method:Male SD rats fed a high-glucose and hyper-lipid diet for 4 weeks．Then diabetes mellitus model was induced by a single injection of STZ．Diabetes SD rats were randomly divided into model group，low-dose APS group，highdose APS group and metformin group．Low-dose APS group，high-dose APS group and metformin group were treated with 400 mg·kg－1·d－1，800 mg·kg－1·d－1of APS，and 160 mg·kg－1·d－1of metformin respectively．Another 12 rats were assigned to the control group and received nothing treatment．After 12 weeks，the levels of fasting glucose，insulin in serum，triglyceride and total cholesterol were measured．Furthermore，the(HE)staining and TUNEL staining of myocardial tissue was conducted．In addition，the expression level of ErbB2，AKT，Bax and Bcl-2 were performed using western blotting methods．Result:Compared to the control group，the levels of fasting glucose，triglyceride and total cholesterol increased significantly，and insulin in serum decreased dramaticly in model group．In contrast，the levels of fasting glucose，triglyceride and total cholesterol decreased，and the level of insulin in serum increased in high-dose APS group and metformin group．Moreover，myocardial tissue apoptosis increased markedly in model group，and decreased significantly in high-dose APS group and metformin group．In addition，the expression level of ErbB2，AKT，Bcl-2 were up-regulated significantly，and Bax expression was down-regulated significantly in model group．However，high dose of APS and metformin could reverse this situation:increased ErbB2，AKT，Bcl-2 expression and decreased Bax expression．Conclusion:High dose of APS had a beneficial effect on heart function by decreasing the level of glucose and lipid and relieving the heart damage in diabetic cardiomyopathy in rat，the mechanism might related to NRG-1/ErbB signal pathway．

Astragalus polysaccharide;diabetic cardiomyopathy;NRG-1/ErbB signal pathway;Myocardial tissue apoptosis

R285．5

B

1006-3250(2016)09-1192-04

2016-02-12

广东省中医药局资助项目(20152053)

常 晓(1981-)，女，副主任医师，在读博士，从事中医药的临床与研究。

△通讯作者:李惠林(1956-)，男，主任医师，博士研究生导师，E-mail:Sztcmlhl@163．com。