甲胎蛋白与肝癌免疫的研究进展

赵 倩, 王小平, 胥 冰, 蔺焕萍, 张克佩

(陕西中医药大学 分子病理学研究室， 咸阳 712046)



甲胎蛋白与肝癌免疫的研究进展

赵 倩1, 王小平2, 胥 冰1, 蔺焕萍1, 张克佩1

(陕西中医药大学 分子病理学研究室， 咸阳 712046)

摘要肝癌是常见的消化道恶性肿瘤，目前没有较好的治疗措施。甲胎蛋白在肝癌细胞中高表达，除了用于肝癌诊断外，其作为肿瘤相关抗原已成为肝癌免疫治疗的靶点。虽然甲胎蛋白免疫原性较弱，并通过抑制树突状细胞，自然杀伤细胞以及T淋巴细胞功能促进肝癌细胞免疫逃逸，但其在肝癌免疫治疗中的作用也日益受到重视，通过体外修饰增强其免疫原性促进免疫应答，从而提高杀伤肝癌细胞免疫效应。甲胎蛋白在肝癌发生、发展及免疫中的作用为研究其在肝癌中的免疫治疗奠定了良好的基础。

关键词甲胎蛋白；肝癌免疫；多肽疫苗；热休克蛋白

Advanced progress in alpha-fetoprotein and hepatocarcinoma immunity

ZHAO Qian1, WANG Xiao-ping2, XU Bing1, LIN Huan-ping1, ZHANG Ke-pei1

(Lab of Molecular Pathology, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

Abstract Hepatocarcinoma is one of the most prevalent gastroenterological cancers in the world with less effective therapy. Excepting for its diagnosis in liver cancer, AFP has become the target for liver cancer immunotherapy. Although AFP′s immunogenicity is weak and can promote the immune escapes by inhibiting the function of dendritic cells, natural killer cells and T lymphocytes, AFP has drawn more attention in liver cancer immunotherapy. By in vitro modification, the immunogenicity and immune effect of AFP could be enhanced. The important role of AFP in development, progression and immunity of liver cancer can lay a better foundation in hepatocarcinoma immunotherapy.

Keywordsalpha fetoprotein; hepatocarcinoma immunity; peptide vaccine; heat shock protein

肝细胞肝癌(Hepatocellilar carcinoma, HCC)是世界上最常见的肿瘤之一，每年新发病的患者高达60万例，在我国已成为恶性肿瘤继肺癌之后的第2位杀手，发病率呈逐年上升趋势。肝癌被称为“癌中之王”，主要是因为隐、长、晚、快、差五大特征：起病隐匿，潜伏期长，患者早期通常没有特殊症状，而一旦发病，往往已是中、晚期，病情发展迅速，预后极差，死亡率高。目前肝癌的治疗主要是以手术切除、肝移植、局部消融、化学治疗栓塞及其他局部区域治疗、分子靶向治疗等为主，但这些方法的疗效并不理想，3年存活率仍然较低，发病率和死亡率几乎相同[1]。肝癌免疫治疗的方法可以刺激人体免疫系统特异性识别并杀伤肝癌细胞而不损伤机体自身成分，并且可以产生记忆性淋巴细胞，防止复发，故肝癌免疫治疗的方法在近几年得到了人们的关注。本文就近年来甲胎蛋白与肝癌免疫的研究进展进行如下综述。

1 甲胎蛋白在肝癌表达中的意义

1.1 甲胎蛋白的发现历史

甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，主要是胚胎内胚层衍生相关组织细胞的同源蛋白产物，广泛分布于呼吸、消化、生殖、泌尿等系统，除肝癌外，胃、胰腺及生殖系统等恶性肿瘤也常伴有AFP升高，并且AFP是幼稚期的产物，血清AFP阴性或弱阳性患者预后较好符合高分化瘤的特点[2]。甲胎蛋白在胎儿血清中含量丰富，从胎儿出生3个月开始，含量逐渐下降，到出生后第2年达到成人体内甲胎蛋白水平，约1～3 ng/mL。成人血中甲胎蛋白维持较低含量，主要是由于成人肝细胞合成AFP的能力丧失。受到相应刺激时，肝脏可重新获得合成AFP的能力，这也是通常肝癌患者体内甲胎蛋白含量升高的原因[3]。

1.2 甲胎蛋白在肝癌诊断中的积极作用

检测血清中甲胎蛋白含量并结合一些影像学的检查，肝癌的临床诊断已逐渐变得简单。但是临床上存在三分之一肝癌患者的甲胎蛋白水平并未明显升高，也就是假阴性的情况，这影响了患者的临床诊断，延误治疗。所以，在甲胎蛋白阴性或弱阳性的情况下，及时确诊肝癌已变得非常急迫且重要。近年来发现一些传统的肝癌标志物与甲胎蛋白联合检测更能提高诊断率。如：能与扁豆凝集素(LCA)结合的甲胎蛋白异质体(AFP-L3)，运用一种高敏感性的方法检测，在AFP阴性的肝癌患者中，敏感度达41.5%，特异度85.1%，比常规方法大有提高[4]。在与甲胎蛋白联合检测时， AFP-L3诊断肝癌的特异度和灵敏度又分别达到90%和70%。大大提高了肝癌的早期诊断率[5]；异常凝血酶原(DCP)[6]、α-L- 岩藻糖苷酶(AFU)[7]等均在甲胎蛋白阴性时对诊断肝癌有一定意义。随着研究工作的进展，肝癌新标志物的出现对肝癌诊断也具有重要意义，如：甲胎蛋白异质体和高尔基体蛋白73联合，肝癌诊断的敏感度为94.0%，特异度为93.1%，而准确度为93.3%[ 8]，使肝癌早期诊断率又有所提高。

1.3 甲胎蛋白除了作为肝癌相关性抗原，用于肝癌诊断外，还有多种生物学功能。如：属于类白蛋白一族的甲胎蛋白也有着相似的运输功能，可运输金属离子、药物、胆红素和类固醇等[9]。

2 甲胎蛋白与肝癌免疫逃逸机制

肝癌细胞能经自身表面抗原修饰作用和病灶周围微环境的改变来实现机体免疫识别和攻击逃逸，从而发生免疫逃逸。外源性甲胎蛋白不仅可以促进肝癌细胞系增殖，促进肿瘤血管形成，同时还增强肝癌细胞的抗凋亡作用[10]。所以，甲胎蛋白在肝癌免疫逃逸中起主要作用。细胞免疫是机体抗癌的主要免疫机制，而树突状细胞、自然杀伤细胞以及T淋巴细胞是参与机体免疫监视最重要的细胞，现主要就甲胎蛋白对这三种最重要细胞的作用来阐述甲胎蛋白的抗肿瘤免疫效应。

2.1 甲胎蛋白抑制树突状细胞(DC)的成熟，诱导其凋亡

DC细胞具有高效摄取、加工、提呈抗原的能力，是唯一能直接激活初始T淋巴细胞的抗原提呈细胞(APC)。甲胎蛋白可以抑制其成熟，并诱导其凋亡从而使肝癌细胞逃避机体的免疫监视功能。有研究将外周血的单核细胞分别培养于脐带血液正常AFP(nAFP)和肿瘤源性AFP(tAFP)中，并分析DC细胞的表型和功能。结果表明，tAFP能显著抑制DCs的分化，受tAFP限制的DC细胞维持单核细胞样形态，并未成熟[11]。并且经AFP处理后的DCs凋亡指数及caspase-3表达量显著增加，说明了甲胎蛋白诱导DC细胞凋亡具有特异性[12]。DCs凋亡过程，除了caspase-3表达增加外，p38丝裂原活化蛋白激酶(MARK)的表达也是增加的。池诏丞等[13]在用AFP诱导培养人外周血来源的DCs时，检测发现，AFP诱导caspase-3和p38-MARK的表达，从而抑制DC细胞成熟，致肝癌细胞发生逃逸。

2.2 甲胎蛋白间接抑制自然杀伤细胞(NK)的功能

NK细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗感染和肿瘤的第一道防线，其表面表达多种受体，包括活化性受体(NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46)和抑制性受体(KIR2DL3/CD158b)。在杀伤肿瘤时会使活化性受体表达下降，抑制性受体表达增强，导致其抗肿瘤效应减弱[14]。所以，增强活化性受体的表达，减弱抑制性受体的表达成为杀伤肿瘤的有效方法。将IL-12注射于肝癌模型小鼠瘤内，发现NK细胞表面的活化性受体表达增强，抑制性受体减弱，并且，IL-12、IFN-r生成增加，达到抑制肿瘤的作用[15]。NK细胞的功能会受甲胎蛋白的影响，甲胎蛋白不直接损伤NK细胞功能，而是通过抑制DC细胞成熟，使DC细胞分泌白介素-12(IL-12)的量减少，从而间接抑制NK细胞的功能[16]。IL-12主要是上调NK细胞表面NKG-2D的表达而改善NK细胞的毒性作用。NKG2D与其配体结合后激活NK细胞，发挥免疫监视作用[17]。

2.3 甲胎蛋白促进T淋巴细胞比例改变，导致肿瘤免疫逃逸

经DC活化后的AFP特异性T淋巴细胞具有显著的体内外抗肿瘤免疫活性，主要机制是特异性的T淋巴细胞上调IL-2、IFN-r、TNF-a、颗粒酶和穿孔素，并且下调有免疫抑制作用的IL-10的含量[18]，CD4+T细胞作为辅助性T淋巴细胞可辅助CD8+细胞毒性T细胞发挥杀伤作用。AFP特异性CD4+、CD8+T细胞杀伤肿瘤主要是通过颗粒酶/穿孔素途径，而对Fas/Fasl途径无影响[19]。虽然甲胎蛋白在T淋巴细胞抗肿瘤免疫中起一定作用，但是由于其免疫原性较弱，并不能很好地刺激免疫系统反应，发挥抗肿瘤作用。而其另一方面的作用却较为显著，那就是促进CD4+T和CD8+T细胞比例改变而导致肿瘤免疫逃逸[20]。有研究人员对临床原发性肝细胞性肝癌患者、慢性乙型肝炎患者和健康患者分别测CD4+的调节性T淋巴细胞(Treg细胞)的含量。结果显示，肝癌患者外周血中Treg细胞含量较高，Treg细胞具有抑制抗肿瘤免疫应答的作用，并且，Treg细胞的聚集会影响CD8+T淋巴细胞的功能，从而使肿瘤细胞逃避机体免疫监视作用，继续在机体内生长[21]。

3 甲胎蛋白在肝癌免疫中的积极作用

3.1 甲胎蛋白促进细胞增殖

甲胎蛋白对细胞增殖的调节也有重要作用，其机制可能是通过受体介导-信息传递-基因表达的方式实现的。因为有研究表明，甲胎蛋白多存在于细胞表面或细胞质内，而胞质中的甲胎蛋白是由受体介导内吞入细胞[22]。并且在甲胎蛋白阳性的组织中，甲胎蛋白受体(AFPR)也呈现阳性。而在正常组织或甲胎蛋白阴性的组织里，AFPR也呈现阴性，说明表达甲胎蛋白受体的细胞对甲胎蛋白更加敏感[23]。甲胎蛋白的生长调节作用是通过CAMP-PKA通路和诱导Ca2+向细胞内流实现的[24]，甲胎蛋白导致Ca2+内流，使细胞内Ca2+增多，同时细胞内CAMP增多，蛋白酶A活性增强，促使DNA合成，达到促进细胞生长的目的。

3.2 甲胎蛋白促进免疫应答

免疫的过程需要增强抗原提呈细胞摄取、加工、提呈抗原的能力，使之激活T淋巴细胞，促进免疫应答[25]。甲胎蛋白虽然促进肝癌增殖，但其作为肝癌的相关性抗原，自然会成为肝癌免疫治疗的新靶点。只是在胎儿胚胎期产生的AFP，机体已将其作为自身抗原，产生一定的免疫耐受，使其促进免疫应答功能降低。如何克服其免疫耐受状态是抗肿瘤免疫的重点。甲胎蛋白氨基酸中存在一些位点可被主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类或Ⅱ类分子识别，递呈给CD8+或CD4+T淋巴细胞，从而活化T细胞[26]，并且靶向性刺激细胞毒性T细胞(CTL)分泌高水平的TNF -a和IFN- r，激发特异性抗肝癌免疫应答[27， 28]。其中，氨基酸组成的免疫显性肽段hAFP(137-145) 可以成功地通过修饰DC诱导外周血单个核细胞成为特异性CTL，且其效果较完整的hAFP蛋白更佳[29]。这样就可以克服甲胎蛋白的免疫耐受现状，以甲胎蛋白为靶点，杀伤肝癌细胞。

3.3 甲胎蛋白在肝癌免疫治疗中的进展

肿瘤免疫治疗具有高效性和低毒性，其目的是启动或重启独立的癌症免疫反应，并使之持续，同时避免损伤自体组织细胞。目前已有临床研究证实免疫治疗可改善肝细胞肝癌患者的预后[30]。胚胎期产生的甲胎蛋白使机体对其保持免疫耐受状态，不能很好地刺激免疫系统，引起免疫反应。Daley等[31]将DC细胞与AFP以及IL-12共孵育，发现自身T淋巴细胞被激活，产生大量IL-12和TNF，可特异性杀伤肝癌细胞，说明甲胎蛋白可与DC细胞制备DC疫苗，发挥一定的免疫效应。将其与“内在免疫佐剂”的热休克蛋白(HSP)重组，组成HSP70-AFP复合物，可增强其免疫原性，刺激机体免疫系统更好地发挥效应[32]。热休克蛋白具有“分子伴侣”功能，可协助蛋白质进行折叠、移位、修复及降解等，在热休克刺激时，可以快速地从细胞中释放出来。在细胞外可提呈抗原、活化免疫细胞、促进Th细胞向Th1转化并激活补体等。肿瘤表达的HSP-70可结合多种肿瘤抗原肽，递呈多个供T细胞识别的抗原表位。并且有更强的活化DC细胞的功能，满足表达率高、特异性强、多克隆活化等特点[33]。研究发现，HSPs的C末端有免疫原性，可刺激免疫细胞产生趋化因子，进而诱导DC成熟[34]。N末端在提呈抗原肽中发挥重要作用。HSP通过HSP抗原肽复合物把抗原呈递给抗原提呈细胞，通过MHC-Ⅰ类分子激发CTL反应，促使DC细胞和巨噬细胞分泌炎性因子，上调CD8和IFN-γ含量，下调TGF-β1的含量[35], 发挥免疫效应。

4 甲胎蛋白在肝癌免疫治疗中的应用前景

4.1 肝癌临床疫苗研发

肝癌疫苗是利用肝癌细胞或抗原诱导机体特异性免疫应答，达到预防治疗肝癌的目的。甲胎蛋白作为肝癌相关性抗原，可促进肝癌的发生[36]，与细胞膜受体结合后通过影响cAMP和Ca2+浓度，从而影响癌基因的表达[37， 38]，并且通过抑制AFP，可以抑制肝癌细胞增殖，并且诱导肝癌细胞的凋亡[39-41]。所以使得甲胎蛋白成为治疗肝癌的新靶点。

4.2 肝癌多肽疫苗的发展

多肽疫苗的优势在于具有免疫应答能力、安全、反应原性低等特点。目前有抗病毒、抗癌、抗疟和避孕等多肽疫苗正在进行临床试验[42]。在肝癌免疫治疗中，由于具有特异性和体内免疫效应持久等优势，DC疫苗表现出良好的应用前景。如何增强DC细胞的抗原提呈功能，发挥强大的杀伤肝癌细胞能力是目前研究的重点。有大量研究取得进展，包括：利用唑来磷酸盐刺激的DC细胞可以使T细胞分泌大量的干扰素，增强细胞杀伤功能[43]；将肝癌患者分离的DC细胞与OK432联合白细胞介素-4与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子共培养2 d，通过动脉导管注入肝癌组织中，可以使血清产生大量IL-9、IL-15及肿瘤坏死因子等，延长患者寿命[44]；为DC细胞加载甲胎蛋白，临床观察发现，此DC疫苗有良好的安全性和耐受性[45]，并且甲胎蛋白的细胞毒性T细胞表位多肽抗原疫苗(MAP)诱导的CTL 反应的能力强于单肽，且只对AFP阳性肿瘤有杀伤效应[46]。由于甲胎蛋白的免疫原性较弱，热休克蛋白以“分子伴侣”“免疫佐剂”的身份走进人们的视野。用免疫组化等方法发现几乎所有肝癌细胞的细胞质中都存在一定水平的AFP和HSP，并且HSP可以将在胞质中的AFP转移至细胞膜并释放抗原至血清，使其暴露[47]。并且，编码AFP和HSP-70的免疫重组疫苗可产生有效的AFP特异性T细胞反应，有效杀伤肿瘤细胞[48]。随着研究的进展，王小平[49， 50]等用戊二醛交联的方法，构建了潜在的治疗性的蛋白疫苗HSP72-AFP或gp96-AFP重组疫苗，这些重组疫苗可以引起特定的抗肿瘤免疫，使得肝癌的治疗研究又向前迈了一大步。

5 小结

综上所述，甲胎蛋白在肝癌发生发展及免疫治疗中均起着重要作用，免疫治疗是目前肝癌治疗方法的重要研究方向，并且肝癌免疫治疗已经在治疗肝癌方面取得一定疗效。虽然目前对免疫治疗的应用还是辅助性的，但随着不断深入地研究，肝癌免疫治疗方法在未来有望发挥更大的作用。

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中图分类号R735.7

文献标识码A

文章编号2095-1736(2016)02-0095-05

作者简介：赵 倩，硕士，主要从事肿瘤分子免疫病理学研究；通信作者:王小平,博士，教授，硕士生导师, 主要从事肿瘤分子免疫病理学研究，Email：wxpphd@aliyun.com。

基金项目：国家自然科学基金项目(81172135，81310108008)；陕西教育厅科研计划项目(07JK233，10JK484，14JS025)

收稿日期：2015-06-02；修回日期：2015-06-25

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.095