硫化氢对组织因子诱导的弥散性血管内凝血家兔体外凝血活性的影响

李乾坤　潘榆春　何　坤　贾大平　李　伟姜玉新王国光(皖南医学院临床医学院，安徽　芜湖　24002)



硫化氢对组织因子诱导的弥散性血管内凝血家兔体外凝血活性的影响

李乾坤潘榆春何坤贾大平李伟1姜玉新1王国光1
(皖南医学院临床医学院，安徽芜湖241002)

〔摘要〕目的探讨硫化氢对组织因子诱导的弥散性血管内凝血( DIC)家兔凝血活性的影响。方法健康青紫蓝家兔通过静脉注射组织因子复制DIC模型。采用全自动凝血分析仪检测活化部分凝血活酶时间( APTT)和凝血酶原时间( PT) ;凝聚法检测血浆纤维蛋白(原)降解产物( FDP)。结果注射组织因子至5 min时，APTT和PT较注射前缩短( P＜0．05)，15、45 min时，APTT和PT较注射前延长( P＜0．05)，注射组织因子后的血样品，FDP检测均出现乳胶颗粒凝集;经硫化氢处理，注射组织因子前血浆PT无明显变化，中、高剂量组APTT延长( P＜0．05)，FDP检测未出现乳胶颗粒凝集;注射组织因子5 min时，中、高剂量组PT较对照组延长( P＜0．05)，高剂量组APTT较对照组延长( P＜0．05) ; 15、45 min时，PT仅在高剂量时较对照组延长( P＜0．05)，APTT在中、高剂量时较对照组均延长( P＜0．05) ; FDP检测，5和15 min时中、高剂量组的乳胶颗粒凝集较对照组明显减弱，45 min时，各组的乳胶颗粒凝集均不明显。结论硫化氢对实验性DIC动物体外凝血有一定的抑制作用。

〔关键词〕硫化氢;弥散性血管内凝血;凝血活性

1皖南医学院基础医学院

第一作者:李乾坤( 1993－)，男，在读本科生，主要从事临床医学研究。

弥散性血管内凝血( DIC)病情发展快、病死率高，其发生是在各种致病因素下，血管内皮损伤从而使内皮下组织暴露激活内源性凝血系统〔1〕，及内皮损伤使组织因子入血激活外源性凝血系统所致;组织因子( TF)是启动外源性凝血系统的关键因子，而外源性凝血系统贯穿于凝血异常病程〔2〕。硫化氢因其有毒对环境造成污染、危害呼吸系统而为人们所熟知，但自上世纪末在脑组织中被发现后，进一步研究发现其还广泛存在于机体的几乎各个组织〔3〕，并调节心血管、神经系统等诸多生理功能〔4〕，且参与许多病理过程〔5〕。但硫化氢对DIC凝血活性的影响作用尚未见报道。因此，本文旨在观察硫化氢对TF诱导的急性DIC动物不同时期体外凝血活性的影响。

1材料与方法

1. 1 DIC模型的建立和分组健康青紫蓝家兔( 1．5～2．0 kg)称重后，以1．5%戊巴比妥钠溶液2 ml/kg经耳缘静脉注射麻醉，仰卧位固定于手术台;然后颈部作切口，分离颈总动脉，并以硅胶管作动脉插管，采血3 ml。以静脉注射兔脑组织TF复制DIC模型。TF使用前加5 ml蒸馏水轻摇混匀，溶解得到冻干兔脑组织TF悬液，37℃水浴15 min。将2 ml/kg兔脑组织TF溶解悬液稀释至30 ml，经耳缘静脉按1 ml/min×5 min，2 ml/min×5 min，3 ml/min×5 min的速度注射以制备DIC模型。开始注射TF 5、15、45 min分别通过动脉插管采血3 ml;离心后取血浆用于相应指标的检测。每份血浆随机分成对照组、硫化氢处理低剂量、中剂量、高剂量组〔分别用25、50、100 μg/ml的硫氢化钠(硫化氢的供体)处理，对照组为血浆〕。

1. 2观察指标采用全自动凝血分析仪检测活化部分凝血活酶时间( APTT)和凝血酶原时间( PT) ;全自动血细胞分析仪进行血小板计数;凝聚法检测血浆纤维蛋白(原)降解产物( FDP)，严格按照试剂盒说明书操作。

2结果

2. 1硫化氢对PT的影响注射TF前各剂量组PT与对照组比较无明显变化( P＞0．05) ;注射TF 5 min时，对照组PT与注射TF前比较明显缩短( P＜0．05)，硫化氢处理组与注射TF前比较无明显变化( P＞0．05)，但与相应的对照组比较明显延长( P＜0．05) ;注射TF 15 min时，与注射前无显著性差别; 45 min时，各组PT较注射前明显延长，且低剂量与中剂量硫化氢处理与对照组比较PT无明显改变( P＞0．05)，高剂量使PT延长( P＜0．05)。见表1。

2. 2硫化氢对FDP的影响在FDP阴性对照检测中，无乳胶颗粒凝集出现; FDP阳性对照检测有较多乳胶颗粒凝集出现;注射TF前血样品中，各组FDP检测均未有乳胶颗粒凝集;而注射TF 5、15 min的血浆中，各组FDP检测均出现乳胶颗粒凝集，且中、高剂量组的乳胶颗粒凝集较对照组明显减弱;注射TF 45 min的血样品的FDP检测中，各组的乳胶颗粒凝集均不明显。见图1。

表1硫化氢对DIC模型家兔PT的影响(±s，s)

表1硫化氢对DIC模型家兔PT的影响(±s，s)

与注射TF前比较: 1) P＜0．05;与对照组比较: 2) P＜0．05;下表同

组别　　注射TF前　5 min　 15 min　 45 min对照组　9．6±0．8　 8．1±0．61)　10．3±0．8　 10．9±1．41)低剂量组　9．5±1．3　 9．1±0．52)　10．5±1．5　 11．5±1．71)中剂量组　9．8±1．6　 9．3±0．92)　11．0±1．8　 12．0±1．41)高剂量组　10．0±1．5　 9．5±0．72)　11．5±1．12)13．4±1．51) 2)

－:阴性对照; +:阳性对照; 1～5、6～10、11～15、16～20分别为注TF前、5、15、45 min时对照组、生理盐水组、低剂量、中剂量、高剂量组图1硫化氢对FDP的影响

2. 3硫化氢对APTT的影响以不同浓度的硫化氢处理注射TF前的血样品，低剂量组APTT与对照组比较无明显变化( P＞0．05)，中、高剂量组APTT明显延长( P＜0．05) ;注射TF 5 min时，各组的APTT与注射TF前比较明显缩短( P＜0．05)，低、中剂量组与对照组比较，APTT无明显变化( P＞0．05)，但高剂量组比较明显延长( P＜0．05) ;注射TF 15、45 min时，APTT比注射前明显延长( P＜0．05)，且低剂量硫化氢处理对APTT无明显改变( P＞0．05)，中、高剂量则使APTT延长( P＜0．05)。见表2。

表2氢硫化对DIC模型家兔APTT的影响(±s，s)

表2氢硫化对DIC模型家兔APTT的影响(±s，s)

组别　　注射TF前　5 min　 15 min　 45 min对照组　31．7±2．1　 29．7±1．61)46．4±8．71)54．9±6．81)低剂量组　34．5±2．7　 31．8±2．21)51．3±6．91)61．45±9．31)中剂量组　37．8±3．32)　33．3±2．81)55．1±7．61) 2)66．3±6．01) 2)高剂量组　42．2±5．32)36．8±4．11) 2)58．6±7．31) 2)68．1±6．41) 2)

3讨论

DIC是由某些致病因子作用而使血液中的凝血因子和血小板相继被激活，并在微血管中形成大量的微血栓，伴随凝血因子及血小板的大量消耗，激发激活纤溶系统，并导致凝血障碍的病理过程。作为新发现的又一内源性信号分子〔6〕，有研究表明，硫化氢预处理可增强机体的抗氧化作用，减轻组织损伤〔7〕。此外，硫化氢还有抗炎、镇痛等作用〔5〕。有研究发现硫化氢具有抑制血小板聚集及阻止血栓形成的作用〔8〕，前期的研究工作发现硫化氢预处理对TF诱发的DIC有保护作用。

DIC的发生是由于许多病因引起的凝血－抗凝血平衡紊乱，并在微循环形成广泛的微血栓的一种临床综合征。内、外源凝血系统的激活导致凝血酶大量产生，使血液凝血活性增强而呈高凝状态，因而在微循环形成大量微血栓。微血栓的形成使凝血因子及血小板等被大量消耗，使血液凝血活性下降而转为低凝状态。TF是激活外源性凝血系统的关键因子，外源性凝血系统的激活在DIC的发生中起着重要作用〔2〕，因此常被用于复制急性DIC模型。本研究表明，由于凝血因子的消耗，凝血活性减低，到45 min时，PT及APTT较5 min时进一步延长，凝血障碍加剧。PT主要反映外源性凝血是否正常〔9〕。APTT测定中的白陶土可激活凝血因子Ⅺ和Ⅻ，以脑磷脂(部分凝血活酶)代替血小板3因子，因此，APTT为内源性凝血系统较敏感和常用的筛选试验。本研究结果提示硫化氢可能通过对内源性凝血系统作用而影响正常血液的凝血活性;低剂量硫化氢即可抑制高凝状态外源性凝血系统的凝血活性，对内源性凝血系统凝血活性的抑制需较高剂量硫化氢，这些结果提示在高凝期时，硫化氢可能对外源性凝血系统较为敏感，尤其在较低剂量对血浆凝血活性的抑制作用可能主要是通过抑制外源性凝血系统;在低凝期硫化氢对APTT较敏感，对血浆凝血活性的抑制作用所需剂量较高，可能与血小板在DIC发展过程中的消耗有关〔8〕。但硫化氢对DIC发生发展过程中血浆凝血活性的影响机制尚需进一步的研究。

综上所述，本研究表明硫化氢对TF诱发的DIC血浆的凝血活性具有抑制作用，并且高凝期时，低剂量的硫化氢即可抑制外源性凝血系统，而低凝期则需较高剂量抑制内、外源性凝血系统。

4参考文献

1 Saracco P，Vitale P，Scolfaro C，et al．The coagulopathy in sepsis: significance and implications for treatmen〔tJ〕．Pediatr Rep，2011; 3( 4) : e30．

2 Van der Poll T．Tissue factor as an initiator of coagulation and inflammation in the lung〔J〕．Crit Care，2008; 12( S6) : S3．

3 Wang R．Physiological implications of hydrogen sulfide: a whiff exploration that blossomed〔J〕．Physiol Rev，2012; 92( 2) : 791－896．

4 Zhao W，Zhang J，Lu Y，et al．The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener〔J〕．EMBO J，2001; 20( 21) : 6008－16．

5 Cheung NS，Peng ZF，Chen MJ，et al．Hydrogen sulfide induced neuronal death occurs via glutamate receptor and is associated with calpain activation and lysosomal rupture in mouse primary cortical neurons〔J〕．Neuropharmacology，2007; 53( 4) : 505－14．

6 Jin BJ，Min HJ，Jeong JH，et al．Expression of EGFR and microvessel density in middle ear cholesteatoma〔J〕．Clin Exp Otorhinolaryngology，2011; 4( 2) : 67－71．

7 Mancardi D，Penna C，Merlino A，et al．Physiological and pharmacological features of the novel gasotransmitter: hydrogen sulfide〔J〕．Biochim Biophys Acta，2009; 1787( 7) : 864－72．

8 Zagli G，Patacchini R，Trevisani M，et al．Hydrogen sulfide inhibits human platelet aggregation〔J〕．Eur J Pharmacol，2007; 559( 1) : 65－8．

9陈文彬，潘祥林．诊断学〔M〕．北京:人民卫生出版社，2012: 301．

〔2015－06－17修回〕

(编辑袁左鸣)

Effects of hydrogen sulfide on in vitro coagulation activity in rabbits with tissue factor-induced DIC

LI Qian-Kun，PAN Yu-Chun，HE Kun，et al.
Clinical Medical College，Wannan Medical College，Wuhu 241002，Anhui，China

【Abstract】Objective To explore the effects of sodium sulfide on in vitro coagulation in rabbits with tissue factor－induced disseminted intravascular coagulation( DIC)．Methods DIC model was prepared by intravenous injection of tissue factor( TF)．Every plasma was assigned into sodium sulfide( treated with 25，50，100 μg/ml sodium bisulfide)，normal saline and control groups．Prothrombin time( PT)，activated partial thromboplastin time( APTT)，and fibrin degradation products( FDP) were determined．Results At 5 min of injection: PT in rabbits treated with sodium bisulfide and APTT in high dose group were significantly prolonged( P＜0．01，P＜0．05)，FDP agglutination was abated in middle and high dose groups; at 15 and 45 min，PT in high dose and APTT in middle and high dose group were prolonged( P＜0．05，P＜0．01)，FDP agglutination was abated in middle and high dose groups．When compared with the prior injection of tissue factor，5 min: PT in control and negative groups，and APTT in all groups were shortened( P＜0．05，P＜0．01)，FDP agglutination was enhanced in all groups; at 15 min，there was not any difference in PT among all groups，APTT was prolonged in all groups( P＜0．05)，FDP agglutination was prolonged in all groups; at 45 min，PT and APTT were prolonged in all groups( P＜0．05，P＜0．01)，FDP agglutination was little．Conclusions Hydrogen sulfide inhibits in vitro coagulation activity in rabbits with TF－induced DIC by its inhibitor to activating coagulation factor．

【Key words】Hydrogen sulfide; Disseminated intravascular coagulation; Coagulation activity

通讯作者:王国光( 1969－)，男，副教授，主要从事弥散性血管内凝血研究。

基金项目:国家自然科学基金项目( 81172790) ;安徽省大学生创新创业训练项目( AH201310368098)

〔中图分类号〕R552

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0257-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 001