维拉帕米联合抗癌药多西他赛对乳腺癌细胞抑制作用的研究

2016-04-09舒湘岑孝感市中心医院药学部湖北孝感432100

中国医院用药评价与分析 2016年2期

舒湘岑(孝感市中心医院药学部，湖北孝感　432100)

舒湘岑*(孝感市中心医院药学部，湖北孝感432100)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.02.018

摘要目的：研究多西他赛与维拉帕米联合应用对多药耐药的人乳腺癌MCF-7/ADR细胞的生长抑制作用。方法：采用噻唑蓝(MTT)法测定药物在体外对MCF-7/ADR细胞的抑制作用，计算半数致死量(IC50值)，并且应用金氏公式进行联合用药的效果分析，此外，还应用流式细胞分析技术进行细胞凋亡和细胞周期的分析。结果：多西他赛联合维拉帕米治疗对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞有显著的抑制作用，抑制率与单一应用多西他赛相比提高了10倍，且IC50值为单独用多西他赛的1/10。金氏公式显示多西他赛与维拉帕米二者联合具有协同作用，细胞周期和细胞凋亡的结果进一步证明二者联用强于单一用药。结论：维拉帕米可以逆转乳腺癌细胞的多药耐药，其与多西他赛联合用药对乳腺癌细胞起到协同作用。

关键词乳腺癌细胞；多西他赛；维拉帕米

Research on Inhibitory Effects of Verapamil Combined with Docetaxel on Breast Cancer Cells

SHU Xiangcen(Dept.of Pharmacy，Xiaogan Central Hospital，Hubei Xiaogan 432100，China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To investigate the inhibitory effects of verapamil combined with docetaxel on human breast cancer cell MCF-7/ADR.METHODS：MTT assay was adopted to determine the inhibitory effects of verapamil combined with docetaxel on breast cancer cell MCF-7/ADR，IC50value was calculated，Jin’s formula was used to analyze the effect of drug combination therapy. Besides，the apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry. RESULTS：The inhibitory effects of verapamil combined with docetaxel in treatment of breast cancer cell MCF-7/ADR is significant， the inhibition ratio of was 10 times higher than that of single docetaxel，the IC50value was 1/10 of single docetaxel. According to Jin’s formula，verapamil combined with docetaxel had strong synergism effects. Moreover，the results of cell cycle and apoptosis also showed that verapamil combined with docetaxel had better effects than docetaxel or verapamil alone. CONCLUSIONS：Verapamil can reverse the multi-drug resistance of breast cancer cells，and when combined with docetaxel can gain the synergistic effects on breast cancer cells.

KEYWORDSHuman breast cancer cells； Docetaxel； Verapamil

随着化疗药物的广泛使用，肿瘤治疗中的多药耐药(multidrug resistance，MDR)问题显得越来越突出，也是目前临床肿瘤治疗中的主要障碍和化疗失败的主要原因之一[1]。肿瘤MDR形成机制非常复杂，药物外排蛋白P-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)在细胞膜上的过度表达，是已经阐明的多种耐药机理中的主要原因[2]。针对P-gp耐药蛋白和耐药机制，肿瘤MDR的逆转策略主要体现在釆用载体给药系统和多药耐药逆转剂逆转MDR。抗癌药物多西他赛的抗癌谱广，适用于多种恶性肿瘤的治疗，但是MDR限制了其临床应用[3-4]。维拉帕米是最早发现的具有逆转肿瘤细胞MDR活性的逆转剂，对多种化疗药物的MDR都有逆转作用[5-6]。本研究探讨维拉帕米和多西他赛共同使用对MDR的人乳腺癌MCF-7/ADR细胞的生长抑制作用，现报告如下。

1材料

1.1仪器与试药

多西他赛(Docetaxel，大连美仑生物技术公司)；维拉帕米(verapamil，上海禾丰制药有限公司)；噻唑蓝(Methylthiazo-lyldiphenyl-tetrazolium bromide，or Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT，大连美仑生物技术有限公司)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；胎牛血清 (杭州四季青生物公司)；碘化丙啶(PI，美国Gibco公司)；CO2培养箱(德国Binder公司)、流式细胞(FACScan，Becton Dickinson，San Jose，CA)；680型酶标仪(BIO-RAD公司)；恒温培养箱(RSBiotech公司)。

1.2细胞株及细胞培养条件

选用人乳腺癌MDR MCF-7/ADR细胞，其细胞表面的P-gp过度表达，且在体内外表现出MDR现象。细胞用含10%小牛血清RPMI1640培养基在37 ℃，含5%二氧化碳(CO2)的培养箱中培养，当细胞贴壁生长至较高密度时(80%～90%)，需要按照1：2或1：3的比例传代，常采用酶消化法，消化液采用胰蛋白酶(0.25%，w/v)。具体步骤如下：将培养皿内的旧培养基以及漂浮的细胞碎片一同倾倒出去，然后用磷酸缓冲盐(PBS)溶液洗细胞3次，加入适量胰蛋白酶，恰好将细胞覆盖即可，置培养箱中孵育1～2 min，倒置显微镜下观察，当细胞开始变圆，细胞间隙增大的时候，加入适量新鲜的含10%小牛血清RPMI1640培养液，轻轻反复吹打，使细胞混合均匀制成细胞悬液，离心5 min (1 000 rpm/min)，吸掉上清液，加入适量含血清的新鲜培养液，混匀后传代，以正常培养条件培养[7]。

1.3统计学方法

本研究中数据采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2方法和结果

2.1细胞抑制率试验

采用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法，分为4组，给药方案如下：(1)空白对照组给予细胞培养液；(2)单用不同浓度的多西他赛溶液(1、5、10 μmol/L)；(3)单用不同浓度的维拉帕米溶液(1、5、10 μmol/L)；(4)多西他赛+维拉帕米，其中多西他赛和维拉帕米的浓度都为1、5、10 μmol/L。取对数生长期的MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞，分别用胰蛋白酶消化并收集细胞，用10%胎牛血清RPMI1640培养液将细胞稀释成一定浓度的细胞悬液，将上述两种细胞分别以6 000个/孔的密度接种在96孔培养板，将培养板移入CO2孵箱中，培养过夜贴壁后，按上述方案给予含药培养液和对照液，每一浓度平行5孔，每孔体积200 μl，在常规培养条件下培养48 h后，每孔加5 mg/ml的MTT液15 μl，37 ℃继续培养4 h后，弃上清液，每孔加100 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，避光振荡l0 min。选择检测为570 nm，在酶标仪上测定各孔吸光度值(A)[8]。按以下公式计算：细胞生长抑制率=(空白对照组平均A值-试验组平均A值)/空白对照组平均A值×100%。并采用Logistic模型拟合量效关系，求半数抑制浓度IC50。

2.2联合效果数据分析

评价药物体外联用细胞毒性作用是否具有协同作用，本研究采用金氏公式判断[9-10]：Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中Ea+b是合并用药抑制率，Ea和Eb分别是A药和B药的抑制率，公式中分子部分Ea+b代表“实测合并效应”，分母部分(Ea+Eb-Ea×Eb)代表“期望合并效应”。Q为两者之比。当Q值为0.85～1.15时，两药作用为单纯相加 (+)，当Q值为1.15～2.0时，为增强 (++)，当Q值为0.85～0.55时，为拮抗 (-)，当Q值<0.55时，为明显拮抗 (--)。

2.3细胞凋亡试验

试验分4组：(1)空白对照组：细胞培养液；(2)多西他赛组：多西他赛溶液；(3)维拉帕米组：维拉帕米溶液；(4)多西他赛+维拉帕米组：其中多西他赛和维拉帕米的浓度分别为为20 μmol/L和5 μmol/L。将对数生长期MCF-7/ADR细胞以6×105个/孔接种于6孔板中，贴壁培养24 h后，加入相应质量浓度的药物进行培养，对照组加细胞培养液，培养48 h后，用0.25%胰酶将细胞消化，离心5 min (1 000 rpm/min)，弃去上清液，用PBS溶液清洗3次。然后用70%的冷乙醇固定4 h，离心3 min (1 000 rpm/min)，加入质量浓度为50 mg/ml的碘化丙啶(PI) 200 μl(终浓度为50 mg/l)，避光在培养箱中37 ℃放置约30 min后，加入PBS溶液400 μl，上机检测用流式细胞仪检测细胞周期，每组至少检测1万个细胞，每一浓度平行3次[11-12]。

2.4细胞周期

当细胞发生调亡时细胞周期各时相的百分比与正常细胞有所变化。因而，通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的凋亡。将对数生长期MCF-7/ADR细胞以6×105个/孔接种于6孔板中，贴壁培养24 h后，加入相应质量浓度(5 μmol/L)的药物进行培养，对照组加细胞培养液，培养24 h后，用PBS溶液洗涤2次，然后用70%的冷乙醇固定4 h，于4 ℃冰箱保存。取固定后的细胞，用PBS洗2次，加入脱氧核糖核酸酶和PI 200 μl(终浓度为50 mg/L)，4 ℃避光染色30 min，上机检测。

2.5细胞抑制率试验(MTT法)

表1显示药物对细胞的抑制率，对于维拉帕米溶液，在1～10 μmol/L的浓度范围内，其对MCF-7/ADR细胞生长抑制效果比较微弱，可以忽略不计。即使在较高浓度10 μmol/L的条件下，其抑制浓度仅为(6.88±0.19)%。而多西他赛是一种抗癌药，对乳腺癌细胞有一定的抑制作用，且对这种细胞生长抑制效果具有明显的浓度依赖性。当溶度为10 μmol/L时，其抑制率达到了(19.25±0.47)%. 但是当多西他赛与维拉帕米两种药物合用后，其抑制率显著增强，与单独多西他赛相比，抑制率提高了10倍左右，可取得更好的细胞毒作用。根据金氏公式计算，两种药物的作用明显增强，提示两种药物对于MCF-7/ADR细胞具有协同作用。

2.6药物对MCF-7/ADR细胞的IC50值

药物对MCF-7/ADR细胞的半数致死量能够定量的表示药物抗癌作用的强弱，具体的IC50值如表2所示，多西他赛、维拉帕米，多西他赛+维拉帕米三种不同的药物样品的IC50值分别为(26.04±0.59)、(80.12±1.24)、(2.26±0.16) μmol/L。MCF-7/ADR细胞对多西他赛溶液具有明显的耐药现象，而当多西他赛和维拉帕米溶液联合给药时，由于维拉帕米逆转了乳腺癌细胞MCF-7/ADR的MDR，使多西他赛更好地发挥作用，显著增强了其对细胞的抑制作用，IC50值是单一用多西他赛药物的1/10。

2.7细胞凋亡

选择多西他赛溶液浓度为20 μmol/L，维拉帕米浓度为5 μmol/L (该浓度具有明显的逆转P-gp引起的耐药作用)进行细胞凋亡试验。表3显示药物作用24 h后，多西他赛溶液可以轻微地使耐药细胞MCF-7/ADR出现凋亡，而维拉帕米基本上不引起细胞的凋亡。当上述两种药物联合使用后，细胞凋亡率明显提高，高达65.98%。

2.8细胞周期

当细胞发生调亡时细胞周期各时相的百分比与正常细胞有所变化。因而，通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的凋亡。细胞周期如表4所示，加药各组的细胞凋亡率与空白对照组进行比较，单独维拉帕米后对细胞各周期分布的影响差异无统计学意义(P>0.05)，这是由于维拉帕米对于细胞的抑制作用很微弱，基本不影响细胞周期的变化。多西他赛是细胞周期非特异性抑制的抗肿瘤药，加入多西他赛之后，阻滞于G2/M 期的细胞明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，使得处于G0/G1和S期的细胞有不同程度地减少，表明药物通过抑制细胞的有丝分裂，进而延长细胞的有丝分裂期使细胞产生凋亡。多西他赛在合用维拉帕米后使得处于G2/M期的细胞与对照组相比显著增多，细胞明显被阻滞于G2/M期而逐渐凋亡，并且加用维拉帕米后处于G2/M期的细胞与多西他赛组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示两药对细胞周期的影响具有协同作用。

表1　药物对MCF-7/ADR细胞作用24 h后的抑制率(%)

表2多西他赛和维拉帕米制剂对MCF-7/ADR细胞的

Tab 2　IC50 value of docetaxel combined with verapamil

Tab 3　Apoptosis of drugs on MCF-7/ADR cells

药品凋亡率(FCM,%)多西他赛20μmol/L11.37±1.32维拉帕米20μmol/L2.49±0.07多西他赛20μmol/L+维拉帕米5μmol/L65.98±2.34

表4　药物对MCF-7/ADR细胞作用24 h后的细胞周期变化

3讨论

多西他赛是治疗乳腺癌最有效的药物之一，其在细胞内滞留时间长、浓度高，作为半合成的紫杉类抗肿瘤药物，可以通过诱导小管聚合并抑制已形成微管束解聚，从而使微管束失去传导功能，同时具有稳定性，进而阻断肿瘤细胞的M与G2期，抑制其有丝分裂[13]。本研究将多西他赛在多药耐药的乳腺癌细胞MCF-7/ADR细胞上进行了细胞抑制率试验，细胞周期和细胞凋亡试验，由细胞抑制率试验结果以、IC50以及金氏公式计算可以得知，与单独多西他赛相比，当加入另一种药物维拉帕米后，可明显的恢复多西他赛浓度依赖性所引导的细胞毒性，可取得更好的细胞毒效果。而维拉帕米单独对于细胞的抑制作用很微弱，基本不影响细胞周期的变化。这是由于MCF-7/ADR细胞表面过度表达P-gp，正是由于P-gp，使药物多西他赛被P-gp泵出细胞，达不到一定的浓度，从而影响其治疗作用[14]。而维拉帕米是第1代的P-gp抑制剂，可以抑制P-gp的泵出作用，随着维拉帕米浓度的增大，其所逆转耐药作用也越来越明显，其也能更好地发挥作用[15]。

通过细胞凋亡试验进一步证实了多西他赛和维拉帕米具有协同作用。当细胞发生调亡时细胞周期各时相的百分比与正常细胞有所变化，因此通过细胞周期同样可以分析抗癌药物对癌细胞的抑制作用。维拉帕米对于细胞的抑制作用很微弱，基本不影响细胞周期的变化。多西他赛是细胞周期非特异性抑制的抗肿瘤药，加入多西他赛之后，阻滞于G2/M 期的细胞明显增多，而处于G0/G1和S期的细胞有不同程度地减少，药其通过抑制细胞的有丝分裂，进而延长细胞的有丝分裂期使细胞产生凋亡。多西他赛在合用维拉帕米后使得处于G2/M期的细胞显著增多，细胞明显被阻滞于G2/M期而逐渐凋亡，这种现象同样提示两药对细胞周期的影响具有协同作用。

需要注意的是，在治疗过程中出现的MDR限制了多西他赛的疗效。维拉帕米是第1代P-gp抑制剂，在过度表达的MDR肿瘤细胞中能够逆转耐药现象。当两种药物联合使用时，可以起到协同抑制肿瘤细胞的作用，效果显著。

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