高效液相色谱法同时测定肝微粒体中咪达唑仑及代谢产物含量

胡春伟(郑州市第一人民医院药剂科，郑州　450001)



高效液相色谱法同时测定肝微粒体中咪达唑仑及代谢产物含量

胡春伟*(郑州市第一人民医院药剂科，郑州450001)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.01.018

摘要目的: 建立高效液相色谱法测定大鼠肝微粒体中咪达唑仑及1-OH咪达唑仑的含量。 方法：色谱柱为COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇∶乙腈∶水(V∶V∶V=55∶11∶34)，流速为1.0 ml/min，柱温为25 ℃，检测波长为220 nm。结果：咪达唑仑和1-OH咪达唑仑线性范围分别是1.0～64.0 μm(r=0.999 2)和0.125～8.0 μm(r=0.999 4)，呈良好的线性关系。咪达唑仑的批内、批间精密度为3.7%～11.2%和4.2%～13.1%，提取回收率为(91.46±9.03)%～(94.54±7.62)%；1-OH咪达唑仑的批内、批间精密度为5.9%～10.4%和7.7%～12.3%，提取回收率为(92.27±8.11)%～(95.16±5.72)%。咪达唑仑和1-OH咪达唑仑在室温保存8 h、反复冻融3次和-20 ℃保存1周含量稳定，与新鲜样品比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论：本法快速、准确、重现性好，可同时测定大鼠肝微粒体中咪达唑仑及1-OH咪达唑仑的浓度。

关键词咪达唑仑； 1-OH咪达唑仑； 高效液相色谱法

Simultaneous Determination of Content of Midazolam and Its Metabolite in Liver Microsome by HPLC

HU Chunwei(Dept.of Pharmacy, the First People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450001, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a HPLC method for content determination of midazolam and 1-OH midazolam in rat liver mircosome. METHODS: The column was COSMOSIL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)with the mobile phase of methanol-acetonitrile-water (V∶V∶V=55∶11∶34) at flow rate of 1.0 ml/min. The temperature was 25 ℃, and the detection wavelength was at 220 nm. RESULTS: The liner range of midazolam and 1-OH midazolam were respectively 1.0～64.0 μm(r=0.999 2) and 0.125～8.0 μm(r=0.999 4). The RSD range of intra-precision and inter-precision of midazolam were respectively 3.7%～11.2% and 4.2%～13.1%, and the average extraction recoveries were (91.46±9.03)%～(94.54±7.62)%, meanwhile, the RSD range of intra-precision and inter-precision of 1-OH midazolam were respectively 5.9%～10.4% and 7.7%～12.3%, and the average extraction recoveries were (92.27±8.11)%～(95.16±5.72)%. The tests for the stability showed that there is no significantly difference between midazolam and 1-OH midazolam during the storage at room temperature for 8 hours, Freeze-thaw cycles for 3 times and stored at -20 ℃ for 1 week(P>0.05). CONCLUSIONS: The method is simple, accurate and repeatable, and can be used for the simultaneous concentration determination of midazolam and 1-OH midazolam in rat liver mircosome.

KEYWORDSMidazolam; 1-OH midazolam; HPLC

咪达唑仑为短效苯二氮卓类药物，在临床上广泛应用于诱导麻醉、镇静和控制癫痫持续状态[1]。CPY3A是肝药酶家族中含量最为丰富的一个亚家族，咪达唑仑是美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)推荐进行CYP3A体外、体内研究的探针药物[4-6]。咪达唑仑在体内主要代谢为1-OH咪达唑仑，并且其代谢速度可以反映出CYP3A的活性。文献报道测定咪达唑仑的方法包括高效液相-紫外检测法(HPLC-UV)、液-质联用法(HPLC-MS)、气-质联用法(GS-MS)等[7-10]。尽管质谱检测器具有灵敏度较高、所需样品体积小等优点，但是由于其使用及维护价格较为昂贵，导致其在临床和实验室研究过程中应用受到局限。目前报道的检测咪达唑仑HPLC-UV中，大多数存在灵敏度低、保留时间长和使用流动相价格较贵等缺点。为此，本试验建立了同时检测肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物1-OH咪达唑仑浓度的HPLC-UV检测法，为CYP3A代谢药物研究提供了一种快速简便、准确可靠的方法。

1材料

1.1仪器

岛津LC-2010A高效液相色谱系统(日本岛津公司)；SPA-10AVP UV/VIS检测器；LC-Solution工作站；Biofuge Stratos型低温高速离心机(Heraeus，德国)；XW-80A型旋涡混合器(江苏金坛医疗仪器厂)；BP121S电子分析天平(Sartorious，德国)。

1.2药品与试剂

咪达唑仑注射液(江苏恩华药业股份有限公司，批号：20141008)；1-OH咪达唑仑(cerilliant analylical reference standards，批号：FN-31309-01)；甲醇、乙腈(色谱纯)；天津四友精细化学品有限公司；水为纯化水；其他试剂均为国产。

1.3试验动物

SD雄性大鼠，体质量250～300 g，由河南省中医学院实验动物中心提供，动物合格证号：0008906。

2方法与结果

2.1色谱条件

COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相∶甲醇∶乙腈∶水(V∶V∶V=55∶11∶34)；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；进样量：20 μl。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备：在具塞塑料离心管中加入磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.0)，咪达唑仑标准溶液，肝微粒体蛋白重悬液(0.25 mg/L),使之成为200 μl体系。涡旋均匀后，加入乙腈终止反应，涡旋2 min，15 000 g冷冻离心10 min，取上清液20 μl进样，记录色谱图。

2.2.2方法学考察：(1)专属性:将空白肝微粒体、一定浓度的咪达唑仑标准液和一定浓度的1-OH咪达唑仑标准液，按照“2.2”项下处理方法，进样，记录色谱图。(2)标准曲线的制备:在具塞离心管中分别依次精密加入咪达唑仑标准液和1-OH咪达唑仑标准液适量，氮气吹干，再加入磷酸盐缓冲液，体系同“2.2”，涡旋混合均匀后，配成含咪达唑仑1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μm和1-OH咪达唑仑0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μm的标准系列浓度的样品体系，按照“2.2”项下处理方法，对样品进行处理后进样，记录色谱图峰面积(A)。以样品中待测物质的浓度C为横坐标，以样品峰面积A为纵坐标做线性回归，得到标准曲线。

2.3精密度试验

在具塞离心管中，按照标准曲线的制备方法，分别配制成咪达唑仑的终浓度为2.0、16.0、64.0 μm，1-OH咪达唑仑的终浓度为0.25、2.0、8.0 μm的待测样品各5份，按照“2.2”项下处理方法，对样品进行处理后进样，记录色谱图峰面积(A)。测得体系中咪达唑仑和1-OH咪达唑仑的精密度。根据标准曲线计算相应的浓度。1 d内对高、中、低浓度样品分析5次，得到批内精密度，连续3 d测定3个分析批，得到批间精密度。

2.4回收率试验

在具塞离心管中，按照标准曲线的制备方法，分别配制成咪达唑仑的终浓度为2.0、16.0、64.0 μm，1-OH咪达唑仑的终浓度为0.25、2.0、8.0 μm的待测样品各5份，按照“2.2”项下处理方法，对样品进行处理后进样，记录色谱图峰面积(A)，带入标准曲线，考察样品的回收率。

2.5稳定性试验

在具塞离心管中，按照标准曲线的制备方法，分别配制成咪达唑仑的终浓度为2.0、16.0、64.0 μm，1-OH咪达唑仑的终浓度为0.25、2.0、8.0 μm的待测样品各5份，分别置室温8 h、反复冻融3次和-20 ℃保存7 d条件下，按照“2.2”项下处理方法，对样品进行处理后进样，记录色谱图峰面积(A)，带入标准曲线，考察样品的稳定性。

2.6专属性试验

在选定“2.1”项下的色谱条件，1-OH咪达唑仑和咪达唑仑峰型尖锐，分离完全，大鼠肝微粒体中无内源性物质和杂质干扰。咪达唑仑和1-OH咪达唑仑的保留时间分别为9.6 min 和7.1 min，见图1。

2.7标准曲线

取空白肝微粒体重悬液配制成含咪达唑仑1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μm和含有1-OH咪达唑仑0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μm的系列浓度样品和的系列浓度样品，按照“2.2”项下处理并测定，原始数据见表1~2。以峰面积A对肝微粒体中相应的咪达唑仑和1-OH咪达唑仑浓度做线性回归，咪达唑仑在1.0～64.0 μm之间线性关系良好，回归方程为：Y=0.0137X-0.077 (r=0.999 2)，1-OH咪达唑仑在0.125～8.0 μm之间线性关系良好，回归方程为：Y=0.0135X+0.0339(r=0.999 4)。

表1　肝微粒体中系列浓度咪达唑仑与峰面积

表2　肝微粒体中系列浓度1-OH咪达唑仑与峰面积

2.8精密度试验结果

测得咪达唑仑和1-OH咪达唑仑的低、中、高3个浓度的批内、批间差结果见表3，结果显示，二者批内、批间RSD﹤15.0%。

2.9回收率试验结果

测得咪达唑仑和1-OH咪达唑仑的提取回收率结果见表4。结果显示，二者的低、中、高浓度的提取回收率，均符合生物样品测定要求。

2.10稳定性试验

测得肝微粒体中1-OH咪达唑仑和咪达唑仑的低、中、高浓度室温保存8 h、反复冻融3次、-20 ℃下保存1周的结果见表5。结果经过配对t检验显示，上述处理组的样品和新鲜配制的待测样品比较，差异无统计学意义(P>0.05)，符合血浆中生物样品稳定性的测定要求。

(A) 空白肝微粒体 (B) 含咪达唑仑肝微粒体 (C) 含1-OH咪达唑仑肝微粒体(A) blank liver mircosome (B) liver mircosome with midazolam (C)liver mircosome with 1-OH midazolam图1　大鼠肝微粒体中咪达唑仑和1-OH咪达唑仑HPLC色谱图Fig 1　HPLC chromatograms of midazolam and 1-OH midazolam in rat liver mircosome

样品浓度/μm批内精密度批间精密度x±sRSD/%x±sRSD/%咪达唑仑2.02.11±0.2211.22.03±0.2613.116.015.8±1.076.715.6±1.267.964.064.68±2.573.763.63±2.694.21-OH咪达唑仑0.250.26±0.0210.40.26±0.0211.12.01.94±0.178.91.93±0.2412.38.08.05±0.475.97.92±0.617.7

表4　肝微粒体中咪达唑仑和1-OH咪达唑仑提取回收率结果

表5　肝微粒体中咪达唑仑和1-OH咪达唑仑稳定性结果

3讨论

咪达唑仑在体内外的代谢速率可以作为大鼠和人体肝CYP3A活性的重要指标之一。据文献报道，测定咪达唑仑的方法中，往往仅能检测出咪达唑仑，而不能对其代谢产物1-OH咪达唑仑进行定量[11-13]，本研究建立了一个在大鼠肝微粒体中同时检测该2种物质的方法。咪达唑仑在生物样品中的提取多采用甲苯、氯仿、乙酸乙酯和乙醚萃取的方法，萃取法提取回收率低，并且所使用的甲苯、氯仿、乙醚等有机溶剂具有毒性，对人体危害较大；乙酸乙酯不易挥发，萃取操作时间较长。本研究采用在反应体系中加入乙腈直接沉淀蛋白的方法，离心后直接进样，有机溶剂暴露时间短，不用萃取，操作简便，色谱峰杂质干扰少，回收率高。

据文献报道，咪达唑仑的保留时间较长[13]，本文考察了甲醇、乙腈和水作为不同比例作为流动相对分离测定的影响，结果显示，当甲醇∶乙腈∶水(V∶V∶V=55∶11∶34)时，1-OH咪达唑仑和咪达唑仑保留时间短，分离度好。

本研究建立的方法可同时检测大鼠肝微粒体中的咪达唑仑及其代谢产物1-OH咪达唑仑的含量，其专属性、线性范围、精密度、回收率和稳定性均符合生物样品的分析要求，为研究大鼠和人体肝CYP3A的代谢提供了一个高效、简便、快捷的方法。

参考文献

[1] Bodmer M, Link B, Grignaschi N, et al. Pharmacokinetics of midazolam and metabolites in a patient with refractory status epilepticus treated with extraordinary doses of midazolam[J]. Ther Drug Monit, 2008,30(1):120-124.

[2]康凯,孙彤,陈明,等.地佐辛联合咪达唑仑持续泵注在ICU机械通气中的镇静效果[J].广东医学,2015,36(21):3296-3298.

[3]Olsen LR, Gabel-Jensen C, Wubshet SG,et al. Characterization of midazolam metabolism in locusts: the role of a CYP3A4-like enzyme in the formation of 1′-OH and 4-OH midazolam [J]. Xenobiotica, 2015(24):1-9.

[4]李治松,张卫,阚全程,等.液-质联用法测定中年妇科病人咪达唑仑及其代谢物的血药浓度并研究其细胞色素P450 3A4酶活性分布特征[J].中国临床药理学杂志,2010,26(3):213-216.

[5]Zamuner S, Johnson BM, Pagliarusco S, et al. Effect of single and repeat doses of casopitant on the pharmacokinetics of CYP450 3A4 substrates midazolam and nifedipine [J]. Br J Clin Pharmacol, 2010 70(4):537-546.

[6]Foti RS, Rock DA, Wienkers LC, et al. Selection of alternative CYP3A4 probe substrates for clinical drug interaction studies using in vitro data and in vivo simulation [J]. Drug Metab Dispos, 2010 38(6):981-987.

[7]Mastey V, Panneton AC, Donati F, et al. Determination of midazolam and two of its metabolites in human plasma by high-performance liquid chromatography [J]. J Chromatogr B Biomed Appl, 1994, 655(2):305-310.

[8]Lauber R, Mosimann M, Bührer M, et al. Automated determination of midazolam in human plasma by high-performance liquid chromatography using column switching [J]. J Chromatogr B Biomed Appl,1994,654(1):69-75.

[9]Petsalo A, Turpeinen M, Pelkonen O, et al. Analysis of nine drugs and their cytochrome P450-specific probe metabolites from urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry utilizing sub 2 microm particle size column [J]. J Chromatogr A, 2008,1215(1-2):107-115.

[10]Martens J, Banditt P. Simultaneous determination of midazolam and its metabolites 1-hydroxymidazolam and 4-hydroxymidazolam in human serum using gas chromatography-mass spectrometry [J]. J Chromatogr B Biomed Sci Appl,1997,692(1):95-100.

[11]Van Brandt N, Hantson P, Mahieu P, et al. A rapid high-performance liquid chromatographic method for the measurement of midazolam plasma concentrations during long-term infusion in ICU patients [J]. Ther Drug Monit, 1997,19(3):352-357.

[12]Odou P, Robert H, Luyckx M, et al. A routine HPLC method for monitoring midazolam in serum [J]. Biomed Chromatogr, 1997，11(1):19-21.

[13]Yasui-Furukori N, Inoue Y, Tateishi T. Sensitive determination of midazolam and 1′-hydroxymidazolam in plasma by liquid-liquid extraction and column-switching liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection and its application for measuring CYP3A activity [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2004,811(2):153-157.

(收稿日期：2015-09-07)

中图分类号R927.11

文献标志码A

文章编号1672-2124(2016)01-0042-04

*副主任药师。研究方向：妇科临床用药指导。E-mail:Tofkj@126.com