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猪流行性腹泻病毒检测与S蛋白中和抗原表位基因分析

2016-04-07丁卫星王荣谈郭佳宏廖学文缪德年

上海农业学报 2016年1期
关键词:进化树

丁卫星,王荣谈,郭佳宏,廖学文,缪德年*

(1上海瑞丰农业科技有限公司,上海201106;2上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106)



猪流行性腹泻病毒检测与S蛋白中和抗原表位基因分析

丁卫星1,王荣谈1,郭佳宏2,廖学文2,缪德年2*

(1上海瑞丰农业科技有限公司,上海201106;2上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106)

摘 要:应用RT-PCR对2015年江苏、安徽、山东9个猪场的腹泻样品(新鲜粪便、肠道组织等)进行PEDV 和TGV检测,并对检测到的一株PEDV(CHNJPK2015)的纤突蛋白中和抗原表位基因进行克隆测序和遗传进化分析。结果表明:9个猪场PEDV检测阳性率为100%,PEDV个体阳性率为63" 89%,TGEV均未检出,说明本次流行的仔猪腹泻病主要是由PEDV感染引起的。所测毒株与参考毒株可分为3个群,CHNJPK2015株与AVCT12、Br1/87、CHM2013、LZC、SM98等毒株的S蛋白中和抗原表位基因的遗传距离较近,核苷酸序列同源性达99" 5%—99" 8%,处于同一群;而与2014年中国各地分离的CH/GDZQ/2014、FJ-FQ 2014、FJ-ZP 2014、PEDV-LY、PEDV-WS、PZ1406、SC1402、SH1404和疫苗株CV777序列的遗传距离较远,核苷酸序列同源性为92" 9%—96" 2%,处于不同的群。

关键词:猪流行性腹泻病毒;S蛋白;进化树

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的,以严重的肠炎、腹泻、呕吐、脱水和仔猪高死亡率为显著特征的猪急性高度接触性肠道传染病。自2010年底我国猪流行性腹泻疫情暴发以来,该病持续在我国流行蔓延,给养猪生产带来了巨大的经济损失。2013年,PED首次传入美国和墨西哥,2014年扩散到加拿大、多米尼加,引起了全球的广泛关注和重视[1]。PEDV为单股正链RNA病毒,基因组全长为30 000 bp左右,编码纤突蛋白(spike protein,S)、小包膜蛋白(envelope,E)、膜糖蛋白(membrane,M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)等4种主要结构蛋白,其中S蛋白位于病毒粒子的外表面,在病毒侵入宿主细胞和诱导中和抗体产生的过程中发挥重要作用[2]。PEDV的主要中和抗原位于S基因的1 495—1 914 bp[3]。PEDV常与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)混合感染,且这两种病毒引起的临床症状和病理变化非常相似,给临床诊断和防治增加了难度。本研究对2015年江苏、安徽、山东9个临床症状表现腹泻的猪场进行了PEDV 和TGEV的检测,并对一个分离毒株的遗传变异进行分析,以期为该病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小肠及粪便样品于2015年1—4月采自江苏、安徽、山东9个发病猪场具有腹泻临床症状的仔猪。

大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞、pMD18-T载体、RNA提取试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、DL2000 DNA Marker、质粒小量提取试剂盒均为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.2 引物

参考文献[4]设计相关引物(表1),T1和T2用于扩增TGEV的S基因,PS1和PS2用于扩增PEDV 的S基因中和抗原表位序列(1 495—1 914 bp)。引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

表1 TGEV和PEDV扩增引物Table 1 Primers for TGEV and PEDV

1.3 样品处理

将采回的样品用PBS(pH=7" 2)稀释后冻融3次,4℃12 000 r/min离心15 min,取上清200 μL按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板分别进行TGEV和PEDV的PCR扩增(98℃2 min,98℃10 s,55℃10 s,72℃1 min,30个循环,72℃延伸10 min)。扩增产物经1" 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 PEDV S基因的克隆与序列测定

选择条带最亮的1株PEDV(CHNJPK2015株)的PCR产物进行纯化回收,克隆于pMD18-T载体中,转化E.coli JM109感受态细胞,在LB培养基中过夜培养,用质粒小量提取试剂盒提取质粒,以PCR法鉴定重组质粒,阳性质粒交宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.5 PEDV S蛋白中和表位基因遗传进化分析

采用DNAStar软件对测得的CHNJPK2015株PEDV S蛋白中和表位基因序列与我国其他地区的分离株、国外分离株(表2)的PEDV S蛋白中和表位基因进行同源性分析,采用MegAlign软件构建系统进化树。

表2 用于进行S蛋白中和抗原表位基因序列比较的PEDV毒株Table 2 PEDV strains for sequence comparison of neutralizing antigen epitope gene of S protein

2 结果与分析

2.1 临床样品检测

利用RT-PCR的方法对9个发生典型腹泻的猪场进行病原检测,结果表明:9个猪场PEDV检测阳性率为100%,36份病料中的23份样品检出PEDV,个体阳性率为63" 89%,而TGEV均未检出(表3),说明本次流行的仔猪腹泻病主要是由PEDV感染引起的。

表3 9个猪场的腹泻病原检测Table 3 Detection of TGEV and PEDV in 9 pig farms

2.2 PEDV S蛋白中和表位基因的扩增

以病料提取的总RNA反转录合成cDNA,并以此为模板进行PEDV S基因的扩增,扩增产物用1" 5%的琼脂糖电泳凝胶检测,目的片段约为651 bp(图1),与预期结果相符。

M:DNA Marker 2000;1:PEDV S gene图1 猪流行性腹泻病毒CHNJPK2015株S基因的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCRamplification of S gene of PEDV strain CHNJPK2015

2.3 PEDV S蛋白中和抗原表位基因序列分析

利用GeneBank上登录的CV777(AF353511" 1)作为参考,分析S蛋白抗原位点碱基的变化,发现了4个碱基的变化(T1501C,C1508T),导致1个位点的氨基酸发生改变(S503L)。

2.4 CHNJPK2015株S蛋白中和抗原表位基因序列同源性及进化树分析

测序后用DNAStar软件对CHNJPK2015株S蛋白抗原表位基因进行序列分析,结果表明:所测毒株与参考毒株可分为3个群,CHNJPK2015株与AVCT12、Br1/87、CHM2013、LZC、SM98等毒株的遗传距离较近,核苷酸序列同源性达99" 5%—99" 8%,处于同一群;而与2014年中国各地分离的CH/GDZQ/2014、FJ-FQ 2014、FJ-ZP 2014、PEDV-LY、PEDV-WS、PZ1406、SC1402、SH1404和疫苗株CV777序列的遗传距离较远,核苷酸序列同源性为92" 9%—96" 2%,处于不同的群;1999年分离自韩国的Chinju99则自成一群(图2)。

3 讨论

张志等[5]对我国2011—2013年腹泻猪群的组织样品进行PEDV、TGEV和PRoV等3种常见病原学检测,发现3种导致腹泻的病原中,PEDV的阳性率最高达94" 6%。卢冰霞等[6]应用RT-PCR方法对2011 年1月至2014年4月采自广西14个不同地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行检测,发现腹泻仔猪粪便样品中有210份为PEDV阳性,总体阳性率为63"44%。本研究调查了江苏、安徽、山东9个发生腹泻的猪场的病原流行情况,在36份腹泻样品中,PEDV阳性率为63"89%(23/36),猪场阳性率为100%(9/9),均未检出TGEV,说明猪流行性腹泻病毒广泛存在,仍然是近期我国猪群发生腹泻的主要病原。

S蛋白是PEDV重要的结构蛋白,也是主要的抗原蛋白,其核心中和抗原表位经乳酸杆菌表达或从烟草中获取的重组COE蛋白均与PEDV天然抗原具相同反应原性[7],说明PEDV中和抗原表位在其防控和诊断中均具有重要的作用。本研究通过对猪场分离的PEDV CHNJPK2015株S蛋白中和抗原表位基因的分析,发现分离的CHNJPK2015株与2014年我国各地分离的CH/GDZQ/2014、FJ-FQ 2014、FJ-ZP 2014、PEDV-LY、PEDV-WS、PZ1406、SC1402、SH1404和疫苗株CV777序列的遗传距离较远,而与泰国2010年的分离株AVCT12的遗传距离较近。王隆柏等[8]分析了在福建省流行的猪流行性腹泻病毒S、N和ORF3的遗传变异情况,发现7株分离于2012—2013年的PEDV毒株的S和ORF3基因与2008年泰国流行株的亲缘关系比较近。以上研究说明我国流行的PEDV毒株可能来源于泰国,这一情况值得思考和研究。

[1]朱迪国,宋建德,袁丽萍,等" 2013—2014年全球猪流行性腹泻重大疫情分析[J]"中国动物检疫,2014,31(10):42-46"

[2]Kang T J,Seo J E,Kim D H,et al" Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants[J]" Protein Expr Purif,2005,41(2):378-383"

[3]Chang S H,Bae J L,Kang T J,et al" Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]" Mol Cells,2002,14(2):295-299"

[4]Kim S Y,Song D S,Park B K" Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR [J]" J Vet Diagn Invest,2001,13(6):516-520"

[5]张志,董雅琴,刘爽,等"我国部分省份猪流行性腹泻的流行病学监测[J]"中国动物检疫,2014,31(10):47-51"

[6]卢冰霞,秦毅斌,何颖,等" 2011年—2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析[J]"中国畜牧兽医,2015,42(3):549-557"

[7]董丽娜,高凤山,许崇波,等"表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J]"畜牧兽医学报,2008,39(12):1743-1747"

[8]王隆柏,林裕胜,车勇良,等"猪流行性腹泻病毒S、N和ORF3基因的遗传变异分析[J]"畜牧兽医学报,2014,45(11):1830-1836"

(责任编辑:闫其涛)

Detection of porcine epidemic diarrhea virus and analysis of neutralizing antigen epitope gene of S protein

DING Wei-xing1,WANG Rong-tan1,GUO Jia-hong2,LIAO Xue-wen2,MIAO De-nian2*
(1Shanghai Ruifeng Agro-Technology Company Limited,Shanghai 201106,China;2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 201106,China)

Abstract:Detection of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)and transmissible gastroenteritis virus (TGEV)in diarrhea samples(fresh feces and intestinal tissue,etc")of 9 pig farms form Jiangsu,Anhui,Shandong in 2015 were conducted by RT-PCR,and the neutralizing antigen epitope gene of spike protein of isolated PEDV strain(CHNJPK2015)was cloned,sequenced and genetic evolution analyzed" The results showed that the positive rate of PEDV in 9 pig farms was 100%,the individual positive rate of PEDV was 63" 89%,no TGEV was detected,indicating that the diarrhea disease was mainly caused by PEDV this time" The tested strain and reference strains could be divided into 3 groups" The neutralizing antigen epitope gene of S protein of CHNJPK2015 and AVCT12,Br1/87,CHM2013,LZC,SM98 strains showed near genetic distance,the nucleotide sequence homology of them were 99" 5%—99" 8%,belonging to the same group" But the neutralizing antigen epitope gene of S protein of CHNJPK2015 and CH/GDZQ/2014,FJ-FQ 2014,FJ-ZP 2014,PEDV-LY,PEDV-WS,PZ1406,SC1402,SH1404,vaccine strain CV777 isolated in 2014 showed far genetic distance,the nucleotide sequence homology of them were 92" 9%—96" 2%,belonging to different groups"

Key words:Porcine epidemic diarrhea virus;Spike protein;Phylogenetic tree

*通信作者,E-mail:18918162235@163" com

作者简介:丁卫星(1965—),男,本科,推广研究员,主要从事农业技术推广研究工作。Tel:021-62209501

基金项目:上海市科技支撑项目(13391901500)

收稿日期:2015-06-23

文章编号:1000-3924(2016)01-019-04

中图分类号:S852" 65

文献标识码:A

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