基于Cytb基因序列的双齿围沙蚕分子鉴定

岑万 江鑫 周翊韬

摘 要：为构建基于Cytb基因的双齿围沙蚕分子鉴定方法，以福建省沿海养殖的双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）为供试材料，采用DNA测序方法获得双齿围沙蚕的线粒体Cytb基因序列，并对其进行分子鉴定;进一步采用Mega4软件的邻接法（NJ法）构建沙蚕亚科Cytb基因的进化树。结果表明：双齿围沙蚕的PCR扩增产物经测序和Blast比对后，双齿围沙蚕的Cytb基因序列长度为349 bp，与NCBI数据库双齿围沙蚕有97%～99%的相似度，并没有与其他种沙蚕具有相似度;沙蚕亚科进化树中，双齿围沙蚕与多齿围沙蚕相聚，两者相聚后再与阔沙蚕属相聚，沙蚕属与环唇沙蚕属相聚、拟突沙蚕属与刺沙蚕属相聚;研究结果初步证实了线粒体Cytb基因序列可用于双齿围沙蚕的分子鉴定。

关键词：双齿围沙蚕; Cytb基因; PCR鉴定; 进化树

Abstract： In order to construct the molecular identification method of Perinereis aibuhitensis based on Cytb gene， by taking Perinereis aibuhitensis cultured in coastal Fujian as the test material， the mitochondrial Cytb gene sequences of Perinereis aibuhitensis were obtained by using DNA sequencing and its molecular identification was carried out. Furthermore， the neighbor-joining method （NJ method） in Mega4 software was used to construct the phylogenetic tree of Cytb genes in the subfamily. The results showed that after sequencing and Blast aligning of PCR amplified products of Perinereis aibuhitensis， the Cytb gene sequence length of Perinereis aibuhitensis was 349 bp， which was 97%-99% similar to Perinereis aibuhitensis in NCBI database， but was not similar to other species of nereid. In the phylogenetic tree of subfamily sericulaceae， Perinereis aibuhitensis and Perinereis nuntia came together first， and then they were together with Platynereis; Nereis and cheilonereis came together， and so did Paraleonnates and Neanthes Kinberg. The results preliminarily confirmed that the mitochondrial Cytb gene sequence could be used for the molecular identification of Perinereis aibuhitensis.

Key words： Perinereis aibuhitensis; Cytb gene; PCR identification; Phylogenetic tree

沙蠶Nereis succinea由头部、尾部、躯干部构成，整体为长柱形蠕虫状。著名分类学家林奈将其隶属蠕虫纲、软体动物目，后续的分类学家又将其隶属环节动物门、多毛纲。在我国近海，沙蚕共有81种，其中双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis属于沙蚕亚科的围沙蚕属，广泛分布在中国近海、东南亚、印度洋流域[1]，属于福建省沿海的主要经济沙蚕品种。双齿围沙蚕作为重要的无脊椎海洋经济物种，在环境监测、海洋药物开发、饵料利用、人工养殖等方面都有着重要的研究价值[2]。有研究表明，双齿围沙蚕对汞的污染有高敏感度，可用于监测海洋重金属的污染[3]。双齿围沙蚕制成的复合胶囊能够保护胶囊免受胃酸的影响，且能够提高体内药效[4]。双齿围沙蚕是鱼类优良的饵料，甚至有“万能饵料”称号。随着国内外海钓业的不断发展，沙蚕需求量剧增，作为优质饵料的双齿围沙蚕价格大幅升高，其人工养殖产业蓬勃发展[5]。

沙蚕由于形态相近，成体特别是幼体的沙蚕通过外观更是难以区分。目前对双齿围沙蚕鉴定主要依靠形态学，但围沙蚕属的几种沙蚕形态相似，且因环境与地点的不同时常会产生变种[1]。因此寻找一种准确高效的鉴定方法对双齿围沙蚕的研究很有意义。此外，双齿围沙蚕与其他的围沙蚕在形态上主要区别是口环部牙齿的数目与分布，但是由于沙蚕的口器包裹在体内，一般的形态学不易观察，因此急需一种除了形态学以外的鉴定方法。物种鉴定是研究生物多样性的核心，除了传统的形态学鉴定方法，近年来也有研究者利用DNA进行分子鉴定[6]。线粒体DNA是DNA分子标记的一种，其具有结构单一、进化速度快、分子较小的优点，用于分子标记鉴定有较好效果[7]。Cytb（细胞色素b）基因存在于线粒体DNA中，Cytb蛋白对呼吸链的电子转移有重要影响[8]。不同区域的线粒体DNA进化速度有差异，与12S rDNA和16S rDNA相比，线粒体蛋白编码基因Cytb进化得更快，更适宜利用于分子鉴定的研究[9]。目前Cytb基因已经被广泛用于海洋物种鉴定中，Madisha[10]利用部分Cytb基因鉴定两种南非的水獭，

Cutarelli[11]利用Cytb基因对意大利市场常见鱼类进行鉴定。但是同样作为海洋动物的双齿围沙蚕Cytb基因鉴定却鲜见报道。因此，本研究根据已公布的双齿围沙蚕的线粒体序列，利用Cytb基因设计特异性引物，进行双齿围沙蚕分子鉴定的研究，进一步采用NJ法构建沙蚕亚科Cytb基因的进化树，探究了沙蚕亚科间的亲缘关系，旨在为沙蚕物种的鉴定和分类研究提供理论指导和实际参考意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis取自福清市融盛养殖场。

1.2 試验试剂与设备

1.2.1 试剂 蛋白酶K、Quick-DNA Universal Kit试剂盒（Zymo公司）、琼脂糖（SIGMA公司）、引物（福州擎科生物技术有限公司合成）、PCR mixture（全式金公司）、DNA marker（Thermo公司）。

1.2.2 试验设备 主要试验设备有解剖镜、体视荧光显微镜、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、Nanodrop分光光度计。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂盒法提取双齿围沙蚕的基因组DNA 采用Quick-DNA Universal Kit试剂盒提取基因组，取0.05 g的双齿围沙蚕肌肉组织放入EP管，剪碎后加入95 μL无菌水、95 μL Solid Tissue Buffer（blue）和10 μL蛋白酶K。将EP管放入55℃的水浴锅中水浴1.5 h。当组织溶解后，12000 r·min-1离心10 min，取上层液150 μL，移入新的EP管，加300 μL的Genomic Binding Buffer溶液混合均匀。混合液转入Zymo-spin IIC-xl 小管中，12000 r·min-1离心1 min，弃掉下管的液体。再加400 μL的DNA pre-wash Buffer到小管，12000 r·min-1离心1 min。然后加700 μL的g-DNA wash Buffer液体到小管，12000 r·min-1速度下离心1 min，弃掉下管的液体。最后加入37 μL双蒸水。12000 r·min-1离心1 min后得到DNA溶液，之后进行电泳，并用Nanodrop测定DNA完整度和纯度。

1.3.2 双齿围沙蚕Cytb基因片段的克隆和序列测定 在NCBI数据库上查找双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）的线粒体基因组序列，NCBI登录号为NC_023943.1。根据线粒体基因组的注释信息找到沙蚕的Cytb基因信息，并用fasta格式导出。设计引物：上游引物的位置为6100～6200，下游引物的位置为6250～6530。正反向引物序列如下：

据梯度PCR确定最适温度57℃，在此温度下进行PCR产物的大体系扩增。PCR 100 μL体系如下：2 μL模板DNA、1 μL上下游引物、2×PCR mixture 50 μL和无菌水46 μL。分别以供试4种沙蚕的基因组DNA作模板，放入PCR仪扩增。扩增程序为：预变性94℃ 7 min，变性94℃ 1 min，复性57℃ 45 s，72℃延伸2 min，扩增35个循环结束后，72℃再延伸7 min。预期扩增片段大小349 bp，将PCR产物进行1%的凝胶电泳，选择亮度完好、有特异性条带的PCR产物送到公司测序。

1.3.3 进化树分析 用Mega4软件的NJ法构建基于Cytb基因和氨基酸序列的沙蚕亚科的进化树。

2 结果与分析

2.1 双齿围沙蚕的基因组DNA提取

在解剖镜下分别取4种沙蚕肌肉组织0.05 g，用试剂盒法提取。结果如图1所示，获得的基因组DNA片段大小都在10000 bp以上。所提取的基因组DNA大小完整，有清晰的条带，说明该试剂盒能有效地提取双齿围沙蚕基因组DNA。进一步对DNA的纯度进行检测，浓度均在20 ng·μL-1左右，A260/280均在1.80左右。说明提取的DNA纯度高，无RNA、蛋白质污染，可以进行下一步PCR扩增反应。

2.2 双齿围沙蚕的Cytb基因片段扩增

将4个沙蚕的DNA样品作为模板，用所设计的引物在57℃的退火温度下进行PCR扩增，PCR产物的电泳结果如图2所示。结果表明，所扩增的4种沙蚕的片段都在350 bp左右，与引物设计目标产物349 bp相符，条带单一，没有杂带。说明可以成功扩增出双齿围沙蚕的Cytb基因部分片段。为了进一步获取PCR产物的序列，将4个PCR扩增产物送去公司测序。

2.3 双齿围沙蚕的Cytb基因的比对分析

将4个双齿围沙蚕样品的PCR扩增产物经过胶回收后，送测序公司进行序列测定。测定的序列峰图完整，没有重叠峰的出现，表明所得到的PCR产物均为单一条带。将测序得到的双齿围沙蚕的Cytb部分序列在NCBI上Blast比对鉴定，比对结果如图3所示。从图3A可以看出，Graphic Summary只有1条代表高分的线条（相似度98%，即最长的线条），该线条的比对结果是双齿围沙蚕的线粒体DNA序列（Perinereis aibuhitensis mitochondrion，complete genome），其余的线条代表的物种是红猎蝽虫（Rhodnius robustus isolate roBR6o cytochrome b gene， partial cds）和粗糙外刺猛蚁（Ectatomma ruidum isolate 2098_SG_B cytochrome b gene， partial cds）等，比对率均在23%以下，说明扩增出的Cytb部分基因能特异性地比对到双齿围沙蚕的Cytb基因。从图3B可以看出，PCR产物的序列与双齿围沙蚕的线粒体基因组（KF611806.1）上的Cytb基因一致度达到99%，只有2个序列Gaps出现。其余3种双齿围沙蚕PCR产物序列的Blast结果与图3基本一致，不再

呈现结果。因此，扩增得到的PCR产物经过Blast比对，证明了本研究设计的引物能正确扩增出双齿围沙蚕的Cytb基因的部分序列，可以成功用于双齿围沙蚕的分子鉴定。

2.4 沙蚕亚科的Cytb基因进化树分析

从NCBI下载沙蚕亚科中7种沙蚕Cytb基因，种属名与NCBI登录号列于表1。以矶沙蚕科的岩虫为外群，构建自展数为1000的NJ法沙蚕亚科进化树。利用沙蚕亚科Cytb基因的进化树如图4所示，从图4可以看出双齿围沙蚕与多齿围沙蚕相聚，说明两者均为围沙蚕属;两者相聚后再与阔沙蚕属相聚，说明阔沙蚕属在进化位置更靠近围沙蚕属;沙蚕属与环唇沙蚕属相聚、拟突沙蚕属与刺沙蚕属相聚。将进化树与《中国近海沙蚕科研究》中利用形态与功能建立的形态学分类树进行比较，对于双齿围沙蚕的分类地位相一致，都是将双齿围沙蚕与多齿围沙蚕划分为围沙蚕属，不同的地方是刺

3 讨论

双齿围沙蚕的研究价值较高，可作为良好的海洋模式动物和经济饵料生物进行各类研究，利用形态学对其分类，存在易形成误差、样本量多、不能分析基因层次的微观变化情况等缺点[12]。因此，进行双齿围沙蚕分子鉴定研究极为重要。利用Cytb基因进行分子鉴定，是因为Cytb基因作为分子标记基因能有效鉴定物种。邓园等[13]研究结果表明对于双齿围沙蚕Cytb基因片段可能更适合用于群体遗传分化研究，因其比COI基因片段更敏感。线粒体全基因组测序技术发展迅速，已经有较多的沙蚕都已经明确线粒体全基因组，这为本研究创造了外部条件。本研究自行设计的引物能扩增出349 bp的序列长度，4种双齿围沙蚕在Blast上的相似率达97%～99%，无其他沙蚕的干扰项，说明Blast比对结果良好，对于双齿围沙蚕的区分度非常大。本研究构建了基于Cytb基因鉴定双齿围沙蚕的分子鑒定方法，为双齿围沙蚕这一海洋经济物种的科学鉴定提供了理论指导，有利于未来种质保护、养殖业的纯种鉴定等，更为未来难以用形态学鉴定的物种提供了分子鉴定的借鉴。随着测序技术发展及研究的深入，越来越多的沙蚕亚科的Cytb基因将被测出，沙蚕亚科各物种之间的亲缘关系将进一步得到完善，今后将有望彻底理清沙蚕亚科的系统进化关系。

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（责任编辑：林玲娜）