鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）纯化及其检验

张俊平，蒋凤英，杨惠萍，李春华，倪建平，赵本进，何锡忠*

（1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海201106）



鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）纯化及其检验

张俊平1，2，蒋凤英1，2，杨惠萍1，李春华1，2，倪建平2，赵本进2，何锡忠1，2*

（1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海201106）

摘 要：在鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）分离鉴定试验确定为鸽副黏病毒Ⅰ型强毒株的基础上，对该病毒株进行了蚀斑纯化，获得了鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）纯化毒株，并对纯化株传代后进行无菌检验、血凝试验、血凝抑制试验和病毒含量测定。结果显示，该纯化毒株纯净、有血凝性和血凝抑制性，病毒含量为108" 5ELD50/0" 1 mL，初步判定纯化的鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）可作为鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗（S-1株）免疫效力试验攻毒毒株。

关键词：鸽副黏病毒Ⅰ型；纯化；检验

鸽副黏病毒Ⅰ型（Pigeon Paramyxovirusl，PPMV-Ⅰ）病又称鸽新城疫，是由禽Ⅰ型副黏病毒（Avian Paramyxovirusl，APMV-1）引起的急性、高度接触性传染病，以肠炎、严重下痢和神经症状为特征，是危害养鸽业的主要疫病之一［1-2］。该病于1981年首先在苏丹和埃及的信鸽中发现，随后迅速传播到欧洲、美国、加拿大等地［1-3］，我国1985年在香港进口种鸽中分离到此病毒，同年8月珠海拱北动物检疫局在中国台湾引进的种鸽中也检出该病毒，现全国大多数地区已有发病报道［4-6］。目前我国控制鸽副黏病毒Ⅰ型病多用鸡新城疫疫苗，在一些鸽场起到了一定的预防作用，但该病仍有发生，常出现免疫失败［7-8］。目前没有针对此病的特效药，比较成熟、免疫效果好的专用疫苗尚未见报道［9］。为了有效预防该病，开展鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗（S-1株）的研制及疫苗免疫效力试验是必不可少的，免疫效力的成败与选择的攻毒用强毒株的纯净及毒力直接相关。在对鸽副黏病毒Ⅰ型分离株（川沙株）分离鉴定试验确定为鸽副黏病毒Ⅰ型强毒株的基础上，本研究通过蚀斑纯化获得鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）纯化株，并对纯化株进行了相关检验，以期为鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗（S-1株）的研究奠定基础。

1材料与方法

1．1 材料

1" 1" 1 毒株

鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）第5代（E5代）由上海市农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定、保存。

1" 1" 2 试剂

DMEM干粉、琼脂糖、特级新生牛血清（FBS）购自GIBCO BRL公司；中性红购自上海试剂三厂；胰蛋白酶购自上海化学试剂站。

1" 1" 3 试验动物

SPF鸡胚为购自梅里亚-维通实验动物技术有限公司的SPF种蛋自行孵化至所需的日龄获得。

1" 1" 4 无菌检验用培养基

硫乙醇酸盐培养基（T" G）小管、酪胨琼脂（G" A）斜面、葡萄糖蛋白胨（G" P）按常规方法［10］配制。

1" 1" 5 1％红细胞悬液

取SPF青年鸡血液，按常规方法［10］洗涤制备。

1" 1" 6 参考血清

抗鸡NDV阳性血清、EDS76V阳性血清购自中国兽医药品监察所；AIV-H5、AIV-H9、AIV-H7阳性血清购自哈尔滨兽医研究所。

1．2 方法

1" 2" 1 病毒鸡胚复壮

将本实验室保存的鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）E5代用灭菌生理盐水按照1∶10 000稀释，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚15枚，0" 1 mL/枚，37℃继续孵育，24 h照蛋，将死亡鸡胚弃去，以后每6 h照蛋1次，将死亡鸡胚随时取出放于4℃冰箱冷藏，直至56 h全部取出，收获死亡鸡胚尿囊液，混合后分装于西林瓶中，标记为E6代，冷冻保存备用。

1" 2" 2 病毒细胞培养

将E6代病毒冻融1次，按总量10％接种鸡胚成纤维细胞（CEF）单层，37℃吸附1 h，将接种液弃去，加入含2％血清的DMEM营养液，37℃、5 mol/L CO2饱和湿度培养箱中培养，逐日观察病变，当细胞病变达到80％时收获病毒。连续传3代，分别标为C1代、C2代、C3代，冷冻保存备用。

1" 2" 3 病毒蚀斑纯化

用琼脂法做蚀斑。取细胞毒C3代用DMEM倍比稀释，取10－4—10－85个稀释度，按10％接种CEF单层（弃去培养液，用DMEM洗涤2次），每个稀释度接种3个孔，37℃吸附1 h，用DMEM洗涤2次，加入3％预热的琼脂与含4％FBS的2×DMEM混合液，37℃、5％CO2环境中避光培养，每隔6 h观察1次蚀斑形成情况，待蚀斑形成后选取最高稀释度1个典型蚀斑用毛细吸管挑斑，将蚀斑再分别接种CEF单层进行反复纯化4代，获得鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）纯化株，标记为A1代、A2代、A3代、A4代。

1" 2" 4 纯化病毒细胞扩增

将形成CEF单层的细胞培养瓶弃去培养液，用DMEM洗涤2次，A4代种毒用DMEM 1∶10稀释接毒，37℃、5％CO2环境中培养，逐日观察病变，当细胞病变达到80％时收获病毒，获得鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）纯化细胞毒，标记为A4C1，冷冻保存备用。

1" 2" 5 纯化株细胞毒鸡胚传代

按常规方法取原倍、1∶500、1∶1 000、1∶10 000稀释的A4C1病毒液尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，观察鸡胚的死亡情况，直至48 h全部取出，收获死亡鸡胚尿囊液，获得鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）纯化鸡胚毒，标记为A4E1代、A4E2代、A4E3代、A4E4代，冷冻保存备用。

1" 2" 6 无菌检验

按常规方法［10］对鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）收获尿囊液、细胞毒、纯化株细胞毒和纯化鸡胚毒进行无菌检验。

1" 2" 7 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验

应用β-微量法，对鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）收获尿囊液、细胞毒、纯化株细胞毒和纯化鸡胚毒进行血凝效价测定，并用鸡新城疫（ND）标准阳性血清、EDS76V阳性血清和AIV-H5、AIV-H9、AIV-H7阳性血清进行HI试验［11］。

1" 2" 8 鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）A4E3代病毒含量测定

按常规方法［11］测定A4E3代病毒液病毒含量，计算其ELD50。

2 结果与分析

2．1 病毒蚀斑纯化结果

鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）C3代病毒接种CEF后60 h左右形成不同大小的蚀斑，挑取单个蚀斑进行传代，传两代后，出斑时间和蚀斑大小趋于稳定，大约在2 mm（图1）。

图1　纯化后蚀斑（川沙株）Fig．1 The purified plaque（Chuansha strain）

2．2 无菌检验结果

对鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）收获尿囊液、细胞毒、纯化株细胞毒和纯化鸡胚毒进行无菌检验，结果均为阴性。

2．3 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验结果

对鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）收获尿囊液、细胞毒、纯化株细胞毒和纯化鸡胚毒进行HA和HI测定，结果见表1，根据HA试验结果判定病毒含量测定选择A4E3代。

表1　HA和HI试验结果Table 1 Results of hemagglutination test（HA）and hemagglutination-inhibition test（HI）

2．4 鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）A4E3代病毒含量测定

由表2可见，鸡胚集中死亡时间为60 h内，病毒含量为108" 5ELD50/0" 1 mL，符合副黏病毒强毒株致鸡胚死亡时间规律。

表2　病毒含量测定结果Table 2 Determination results of virus content

3 结论与讨论

3" 1 本试验通过对纯化株细胞传代和鸡胚传代获得纯化株的传代病毒，并对纯化株的传代病毒进行了无菌检验、血凝试验、血凝抑制试验和病毒含量测定。试验结果表明：该纯化毒株无菌，具有血凝性，能被ND阳性血清抑制，但不能被禽流感H5、H7、H9株阳性血清、EDS76阳性血清所抑制，因此判定该纯化病毒为鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）纯化株。鸡胚测定病毒含量为108" 5ELD50/0" 1 mL，鸡胚集中死亡时间为60 h内，符合副黏病毒强毒株致鸡胚死亡时间规律。

3" 2 由于直接从病死鸽体内用SPF鸡胚分离获得的病毒可能不单纯为一种病毒，若要想获得纯净的一种病毒必须对分离株进行纯化。本实验室通过蚀斑纯化的方法对鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）进行了纯化。

3" 3 本实验室通过对鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）分离鉴定［12］测得致死鸡胚的平均死亡时间（MDT）为55" 2 h，脑内致病指数（ICPI）为1" 8，静脉致病指数（IVPI）为2" 39，鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）攻毒剂量确定［13］判定该病毒为鸽副黏病毒Ⅰ型强毒株。因此，初步判定鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）纯化株可作为研究鸽副黏病毒Ⅰ型疫苗免疫效力试验攻毒毒株。

参 考 文 献

［1］Alexander D J" Avian paramyxoviride recent developments［J］" Vet Microbiol，1990，23：103-104"

［2］Alexander D J，Russell P H，Parson G，et al" Antigenic and biological characterization of avian paramyxovirus typeⅠisolates from pigeon an international collaboration study［J］" Avian Pathol，1985，14：365-376"

［3］Alexander D J，Russell P H，Collins M S" Paramyxovirus typeⅠinfections of racing pigeon：characterization of isolated viruses［J］" Veterinary Record，1984，114：444-446"

［4］刘业兵，田春利，胡艳丽，等"鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及生物学特征研究［J］"中国家禽，2006，28（24）：63-65"

［5］陈钟鸣，刘怀然，孙敏华，等"鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及其F基因、HN基因的序列分析［J］"中国兽医学报，2010，30（9）：1167-1172"

［6］隋修锟，李刚，李铁，等"四株鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及基因型分析［J］"中国兽医科学，3013，43（2）：136-140"

［7］崔晓萍，秦爱建，崔治中，等"鸽新城疫病毒的分离及鸽群自然感染状况的调查［J］"中国兽药杂志，2000，31（2）：6-10"

［8］杨瑛"鸽新城疫野毒株的分离及生物学特性研究［J］"畜牧与兽医，1998（5）：198-199"

［9］陈丽君"鸽Ⅰ型副黏病毒（HT-40）的纯化与防治试验研究［D］"保定：河北农业大学，2007"

［10］中华人民共和国农业部"中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版［Z］"北京：化学工业出版社，2000"

［11］中国兽药典委员会"中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部［S］"北京：中国农业出版社，2010"

［12］张俊平，杨惠萍，蒋凤英，等"鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）的分离鉴定［J］"中国兽药杂志，2013，47（11）：13-17"

［13］张俊平，杨惠萍，蒋凤英，等"鸽副黏病毒Ⅰ型（川沙株）攻毒剂量研究［J］"病毒学报，2014，30（2）：177-179"

（责任编辑：闫其涛）

Purification and test of pigeon paramyxovirus typeⅠ（Chuansha strain）

ZHANG Jun-ping1，2，JIANG Feng-ying1，2，YANG Hui-ping1，LI Chun-hua1，2NI Jian-ping2，ZHAO Ben-jin2，HE Xi-zhong1，2*
（1Institute of Animal Husbandry＆Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；2Shanghai Jiamu Biological Products Company Limited，Shanghai 201106，China）

Abstract：On the basis of isolation and identification of pigeon paramyxovirus typeⅠas virulent strain （PPMV-Ⅰ，Chuansha strain），the strain was purified by plaque purification，and the purified strain of pigeon paramyxovirus typeⅠ（Chuansha strain）was obtained" The results of sterility test，hemagglutination test，hemagglutination-inhibition test and virus content determination showed that the purified PPMV-Ⅰwas sterility，with hemagglutination and hemagglutination-inhibition，and the virus content was 108" 5ELD50/0" 1 mL" It was preliminary determined that the purified strain of pigeon paramyxovirus typeⅠ（Chuansha strain）can be used as a pigeon paramyxovirus type I virus inactivated vaccine（S-1 strain）challenge strain for immune efficacy test"

Key words：Pigeon paramyxovirus type I；Purification；Test

*通信作者：何锡忠（1966—），男，硕士，兽医师，研究方向为兽医传染病的诊断和疫苗研制，Tel：13817780200；E-mail：sjhxz＠163" com

作者简介：张俊平（1978—），女，硕士，助理研究员，从事动物生物制品研发工作。Tel：15301903906；E-mail：zhangjunping5259＠sina" com

基金项目：上海市科委科技支撑项目（133919N2000）

收稿日期：2014-12-17

文章编号：1000-3924（2016）01-029-04

中图分类号：S852" 4

文献标识码：A