2型糖尿病患者Foxp3基因 rs3761548单核苷酸多态性观察

陈丽丽，唐小平，杨颖丞，万沁，陈枫，丁春兰，陈庄

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)



2型糖尿病患者Foxp3基因 rs3761548单核苷酸多态性观察

陈丽丽，唐小平，杨颖丞，万沁，陈枫，丁春兰，陈庄

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

目的 观察2型糖尿病患者Foxp3 基因rs3761548单核苷酸多态性。方法 选取2型糖尿病患者216例(2型糖尿病组)、2型糖尿病前期患者207例(糖尿病前期组)、健康对照者216例(对照组)。抽取三组受检者外周血，待血液凝固后离心，取下层血凝块约300 μL，提取DNA。采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性法检测基因型。统计各组基因型AA+AC的频数和构成比。结果 经Hardy-Weinberg平衡检验，三组Foxp3基因rs3761548单核苷酸多态性符合遗传平衡。2型糖尿病组基因型为AA+AC型构成比为43.5%(94/216)，明显高于糖尿病前期组的34.3%(71/207)和对照组的32.4%(70/216)，P均<0.05，糖尿病前期组和对照组相比P均>0.05。结论 2型糖尿病患者存在Foxp3 基因 rs3761548单核苷酸多态性，基因型AA+AC构成比高。

叉头框基因3基因；单核苷酸多态性；基因型；2型糖尿病；糖尿病前期

近年来研究发现免疫机制在2型糖尿病发病过程中发挥重要作用[1,2]。CD4+CD25+调节性T 细胞是维持机体免疫自稳的重要T细胞功能亚群[3]。Foxp3 是X 染色体上基因编码的叉头样转录因子家族成员，其主要表达于CD4+CD25+调节性T 细胞，调控CD4+CD25+调节性T细胞的发育及功能表达[4，5]。Foxp3 基因突变会导致CD4+CD25+调节性T细胞功能异常，进而影响糖代谢。2014年1月～2015年12月，我们观察了2型糖尿病患者Foxp3 基因 rs3761548 单核苷酸多态性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取216例2型糖尿病患者(2型糖尿病组)，其中男90例、女126例，年龄(63.6±8.9)岁；207例2型糖尿病前期患者(糖尿病前期组)，其中男67例、女140例，年龄(61.3±9.5)岁；216例健康对照者(对照组)，其中男90例、女126例。三组受检者均来自无亲缘关系的四川泸州地区汉族人群。2型糖尿病及糖尿病前期依据1999年WHO糖尿病标准诊断。排除近期有感染、肝肾功能衰竭、恶性肿瘤、口服降脂药物及有遗传病家族史者。三组性别和年龄分布相比差异无统计学意义。

1.2 Foxp3 基因 rs3761548 单核苷酸多态性检测方法 抽取三组受检者5 mL外周血，待血液凝固后，2 500 r/min离心5 min，取下层血凝块约300 μL按照试剂盒(庄盟ZP314)说明书提取DNA。采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测基因型。PCR反应体系共计12.5 μL，主要成分包括：40 ng 基因组 DNA, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL , 6.25 μL 2×Taq PCR MasterMix(0.1 U Taq Polymerase/μL, 500 μmol/L dNTP,20 mmol/L Tris-HCL,100 mmol/L KCl, 3 mmol/L MgCl2), 余为双蒸水。 PCR反应采用降落PCR反应程序。正向引物序列5′-CCCACAATCAAGGTTTTCG-3′，反向引物序列5′-CAGCGGCAGAGTTGAAATC-3′。PCR反应条件：预变性95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s, 68 ℃(每个循环递降0.5 ℃) 30 s, 72 ℃ 30 s，共30个循环；95 ℃ 30 s, 45 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s共25个循环；延伸72 ℃ 10 min。PCR扩增产物长度为359 bp，用1 U的限制性内切酶Pst Ⅰ于37 ℃将PCR产物酶切2 h，酶切产物用2%的琼脂糖凝胶电泳30 min，用Gel.Doc XR+型凝胶成像系统(美国Bio-Rad) 观察酶切产物。并随机选取部分PCR产物进行测序鉴定(上海生工生物科技公司)。Foxp3 基因 (rs3761548) 单核苷酸多态性位点如果为等位基因C则可以被酶切，如果为等位基因A则不能被酶切。所以酶切之后，基因型AA仍为1个片段(359 bp)，基因型AC为3个片段(359 bp、281 bp、78 bp)，基因型CC为2个片段(281 bp、78 bp)。DNA测序结果与酶切结果一致，AA基因型和CC基因型在单核苷酸多态性位点可见A碱基和C碱基单峰，AC基因型在单核苷酸多态性位点可见碱基A和碱基C叠加双峰。统计各组基因型AA+AC的频数和构成比。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。基因型分布先进行Hardy-Weinberg平衡检验。组间基因型频率比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

经Hardy-Weinberg平衡检验，三组Foxp3基因rs3761548单核苷酸多态性符合遗传平衡。2型糖尿病组基因型为AA+AC型构成比为43.5%(94/216)，明显高于糖尿病前期组的34.3%(71/207)和对照组的32.4%(70/216)，P均<0.05；糖尿病前期组和对照组相比差异无统计学意义。

3 讨论

Foxp3 是X 染色体上基因编码的叉头样转录因子家族成员，人Foxp3 基因定位于染色体Xp11，cDNA 全长1 869 bp，编码产物是一个约48 kD 的含431 个氨基酸的蛋白质。人类Foxp3 基因突变主要包括点突变、mRNA 剪切缺失及亮氨酸拉链区改变，这些改变可能进一步对调节性T细胞产生影响。文献[6]报道，利用siRNA介导的基因沉默技术阻断调节性T细胞中Foxp3 基因的表达，调节性T细胞免疫调节功能降低， 细胞表面分子如CD25、CD45RB、CTLA-4 及GITR 等下调。Fontenot等[7，8]发现Foxp3 突变鼠和Foxp3 缺失鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞数目减少。何云锋等[9]研究发现将，Foxp3表达载体转染至调节性T细胞可增强调节性T细胞分泌IL-10和TGF-β功能。

本研究结果显示，2型糖尿病组AA+AC基因型构成比明显高于对照组，提示Foxp3 基因 rs3761548 单核苷酸多态性可能与2型糖尿病的发生有一定关系。虽然目前对于这种关系的具体机制尚不清楚，但是近年来的研究表明，CD4+Foxp3+调节性T细胞与胰岛素抵抗和代谢综合征有关。Feuerer 等[10]研究发现CD4+Foxp3+调节性T细胞的数量在肥胖小鼠腹部脂肪组织中增加，在存在胰岛素抵抗的肥胖小鼠腹部脂肪组织中减少。另有文献报道，代谢综合征患儿外周血CD4+Foxp3+调节性T细胞数量低于健康对照组，并且其数量随着代谢紊乱的恶化进一步减少[11]，而且代谢综合征患儿CD4+Foxp3+调节性T细胞存在功能异常[12]。CD4+Foxp3+调节性T细胞在胰岛素抵抗和代谢综合征的发生发展中发挥重要作用，Foxp3是调节性T细胞发育和产生功能的关键因素[13]。

由于Foxp3基因对调节性的重要作用，近年来关于Foxp3基因与免疫性疾病关系的研究较多。研究表明，许多自身免疫性疾发病，如哮喘[14]、过敏性鼻炎[15]、类风湿关节炎[16]及系统性红斑狼疮[17]等患者Foxp3 基因表达明显降低。目前己证实人类Foxp3 基因突变和单核昔酸多态性与多种自身免疫性疾病相关，而rs3761548 是Foxp3 基因启动子区一员，是目前研究最为热门的位点之一。文献报道，rs3761548 AA 基因型携带者肾移植后获得免疫排斥反应的概率明显高于rs3761548 CC 型携带者[18]。吴再归等[19]对不明原因流产的研究发现，携带rs3761548 A型等位基因的流产风险增加。另有研究表明[20]，rs3761548 AA型可能有更高的白癜风患病风险。本研究结果也表明，2型糖尿病患者rs3761548单核苷酸多态性AA+AC基因型构成比高于对照组，提示rs3761548单核苷酸多态性可能参与了2型糖尿病的发病机制。接下来的研究中我们将更加深入地研究rs3761548等位基因A对Foxp3基因表达的影响，以及这种影响对调节性T细胞的免疫调节功能有何影响，为阐明2型糖尿病以及相关的自身免疫性疾病的发病机制提供新的方向。

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中华医学会临床医学科研专项资金-施贵宝内分泌糖尿病研究项目(12020160276)；四川省科学技术厅与泸州市人民政府、泸州医学院联合科研专项资金计划项目(14JC01283-LH11)。

唐小平(E-mail： 253254624@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.026

R392.2

B

1002-266X(2016)39-0078-03

2016-06-25)