人脐血间充质干细胞移植治疗长骨骨折术后骨不连17例

2016-04-06岑毕文,吴亚鹏,杨棋等

山东医药 2016年3期

由于近年骨科研究的进步，骨折愈合和治疗的效果已得到极大提高，但在骨修复、骨折愈合程度上依然不足。干细胞的研究应用给骨科疾病带来了新的希望，它能在特定的信号作用下定向分化为骨细胞、神经细胞、骨骼肌细胞等，成为特殊功能的生物组织。干细胞有三个主要来源，即胚胎、成体和脐血，由于脐血间充质干细胞(hUC-MSCs)取材容易，采集方便，供源充足，给骨组织工程带来了一种新的、理想的种子细胞。本研究采用人脐血间充质干细胞移植治疗骨折术后骨不连患者17例，取得良好疗效。

临床资料：骨折术后骨不连患者17例，男10例，女7例；年龄22～65岁，平均36.8岁；病程8～32个月，平均12.5个月。纳入标准：①骨折术后8个月检查显示无骨痂生长，骨折部位无进行性修复迹象，骨折片间隙<5 mm；②无短缩、成角及移位现象；③为非感染性骨不连；④行局部植骨后8个月仍无明显骨痂生长。排除标准：①骨折术后8个月检查显示有部分骨架生长；②确诊骨不连后行局部植骨后8个月有部分骨痂生长；③合并短缩、成角及移位现象；④骨折后骨折端及附近存在感染灶。17例患者中，肱骨骨折5例，胫骨干骨折9例，股骨骨折3例。

hUC-MSCs获取及应用：①hUC-MSCs获取：严格无菌条件下，采集健康产妇志愿捐献的脐带血，取30 mL外周血，用PBS按照1∶3稀释。采用密度梯度离心法，用人淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞，下层为人淋巴细胞分离液，上层为稀释后的外周血，二者体积比为1∶2。以1 500 r/min离心40 min，5档升速，0档降速。离心取白膜层，PBS稀释，330 g×15 min常温离心。再用大体积PBS洗2遍，每遍330 g×10 min。经过磁珠分选及培养获得hUC-MSCs。取第3代细胞应用条件培养基进行成骨诱导2周，控制移植用hUC-MSCs浓度>103/mL，总数>50×107个稀释在30～50 mL中。②hUC-MSCs应用：骨折断端处消毒，行局部麻醉，在X线透视下，采用注射器针头对骨折线定位，确认针尖处于骨折缝隙内，将hUC-MSCs准确注射到骨折端，注射时如感阻力较大，可加压缓慢注射，术后略加压包扎，不使用抗生素。每1～2周1次，连续4次。

疗效评价方法：骨折愈合具体评分参照文献[1]。①骨形成：没有骨形成的表现计0分，骨形成占骨折区的25%计1分，骨形成占骨折区的50%计2分，骨形成占骨折区的75%计3分，骨形成填满骨折断端间隙计4分；②缺损连接：有完全的骨折线计0分，有部分骨折线计2分，缺乏骨折线计4分；③骨塑建：无塑建的表现计0分，可见髓腔内塑建计2分，皮质骨完全塑建计4分。总分达11分以上即达到了良好的愈合效果。

结果：随访3～24个月，平均12.5个月。治疗前骨折愈合评分(3.40±0.42)分，治疗后愈合评分(11.23±0.35)分。愈合时间3～18个月，其中16例(94.12%)达到良好愈合。

讨论：骨折术后骨不连是骨科常见并发症之一，发生率为5%～10%[2]。对于骨折术后骨不连的治疗方法较多，传统方法常需植骨治疗，植骨的来源主要分为自体骨移植和异体骨移植。自体骨移植修复骨缺损不存在免疫排斥，并同时具有骨传导和骨诱导特性，但自体松质骨数量有限，且供区可能会出现并发症，临床上常用于修复较小的骨缺损[3]。异体骨移植来源丰富，但异体移植需要长时间的固定，存在免疫排斥问题，且成骨活性较自体骨差，限制了其在临床上的应用。

近年来，随着干细胞技术的发展，给骨折术后骨不连患者的治疗提供了一个全新的解决方案[4]，其在骨折不愈合、脊髓损伤、周围神经损伤等疾病中的应用均取得了良好效果。相对于传统治疗，MSCs有以下特点及优点：①干细胞是原始分化细胞，移植后对受体的免疫排斥反应小；②对于一般性方法难以治愈的复杂疾病常有良好的效果；③大量实验及临床研究表明治疗效果确切，且有效率高；④治疗过程创伤性小、无痛苦，操作简单、安全；⑤治疗周期短，无明显不良反应，无依赖性；⑥不仅对疾病本身有效，还能对其他人体系统器官有补益作用。

研究[5,6]表明，MSCs能够向成骨细胞分化，移植MSCs能够利用其定向骨分化使骨不连愈合，许多专家采用骨髓间充质细胞治疗四肢骨折骨不连，且取得良好疗效。相对于骨髓、脐带MSCs，hUC-MSCs不表达与移植排斥相关的HLA DR，异体移植该细胞可产生较好的免疫耐受性[7,8]，不但具有外源基因转染和表达的优点，而且具有免疫调节作用，可有效降低GVHD的发生率及严重程度[9]。另外，hUC-MSCs供应充足，能实现无痛性收集及快速培养扩增等突出优点，其得以在临床上得到推广和使用，而个别hUC-MSCs可选择性地分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，具有更强的成骨潜力[10]。本研究采用hUC-MSCs移植，hUC-MSCs总数>50×107个，高于欧洲脐血移植协作组(Eurocord)2006年推荐的脐血细胞数量[11]。本研究显示，治疗后愈合评分高于治疗前，且达到良好愈合者多。本组中个别患者愈合时间稍长，我们分析原因是hUC-MSCs在分离、提纯、培养及浓缩等过程中的诸多因素与骨折愈合关系较为密切，另外许多技术及个体差别的因素，如炎症、固定不牢及成骨障碍、复位不良等也可影响hUC-MSCs的治疗效果。

参考文献：

[1] 刘宝平,李永乐,何强,等.成骨诱导后人脐血间充质干细胞移植对兔骨折愈合的实验研究[J].临床军医杂志,2015,2(43):111-115.

[2] Pugh DM, McKee MD. Advances in the management of humeral nonunion[J]. J Am Acad Orthop Surg, 2003,11(1):48-59.

[3] 周游,曾勇.干细胞在骨科中应用的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2011,7(14):1186-1200.

[4] 金文虎,魏在荣,孙广峰,等.自体外周血干细胞移植治疗周围神经损伤[J].中国组织工程研究,2013,1(17):181-185.

[5] 张传开,史阅,刘英,等.经皮自体骨髓间充质干细胞移植术治疗四肢骨折骨不连41例[J].山东医药,2012,52(2):95-96.

[6] 杨俊丽,韩霞,孙明启,等.骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连:实验成果与转化应用[J].中国组织工程研究,2014,18(45):7337-7341.

[7] Cho PS, Messina DJ, Hirsh EL, et al. Immunogenicity of umbilical cord tissue derived cells[J]. Blood, 2008,111(1):430-438.

[8] 罗建红,何学华,廖金卯,等.人脐血间充质干细胞尾静脉移植治疗扩张型心肌病[J].中国组织工程研究,2013,17(6):1029-1036.

[9] 翁建宇,杜欣,项鹏,等.间充质干细胞治疗激素耐药重度急性移植物抗宿主病[J].实用医学杂志,2010,26(1):80-82.

[10] 王浩,未东兴.人脐血间充质干细胞的体外成骨[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(40):7446-7448.

[11] 乔淑敏.脐血造血干细胞研究进展[J].国际儿科学杂志,2011,38(4):125-129.