白桦酸体外对人肝癌细胞、鼻咽癌细胞增殖及组织血管生成的影响

黄荷云，周尧远，张荣军，蔡刚明，顾晓波，潘栋辉，蒋孟军

(1江苏省原子医学研究所，江苏无锡 214063；2卫生部核医学重点实验室；3江苏省分子核医学重点实验室；4南京医科大学附属无锡人民医院)



白桦酸体外对人肝癌细胞、鼻咽癌细胞增殖及组织血管生成的影响

黄荷云1,2,3，周尧远1,2,3，张荣军1,2,3，蔡刚明1,2,3，顾晓波1,2,3，潘栋辉1,2,3，蒋孟军4

(1江苏省原子医学研究所，江苏无锡 214063；2卫生部核医学重点实验室；3江苏省分子核医学重点实验室；4南京医科大学附属无锡人民医院)

摘要：目的观察白桦酸(BA)对肿瘤细胞增殖及组织血管生成的影响。方法 培养人肝癌细胞株Bel-7402、人鼻咽癌细胞株CNE、人血管内皮细胞株HMEC，分别以不同浓度的BA干预，比较Bel-7402细胞和CNE细胞增殖抑制率、凋亡率，并比较HMEC细胞增殖抑制率、迁移能力、血管形成能力。结果BA可抑制Bel-7402细胞、CNE细胞增殖，促进其凋亡，且呈剂量依赖性(P均<0.05)；BA可抑制HMEC细胞增殖，减弱迁移能力及血管形成能力，且呈剂量依赖性(P均<0.05)。结论 BA可抑制人肝癌细胞、鼻咽癌细胞增殖及肿瘤组织血管生成。

关键词：白桦酸；人肝癌细胞；人鼻咽癌细胞；人血管内皮细胞

血管生成是实体肿瘤生长的决定性因素，肿瘤细胞通过肿瘤血管获得营养与氧气供应，因此抗肿瘤血管生长已成为肿瘤治疗的研究热点。白桦酸(BA)是从多种植物中分离得到的一种五环三萜类化合物，在自然界中分布广泛。早期研究发现，BA对黑色素瘤有细胞毒性作用；近期研究发现,BA具有抗人类免疫缺陷病毒活性、抗炎症和广谱抗肿瘤作用，且存在作用机制特异、分子质量小、低毒性等优点[1～7]。本研究观察了BA对肿瘤细胞增殖及组织血管生成的影响，为进一步研究BA在血管生成中的机制提供理论基础。

1材料与方法

1.1药物、试剂及仪器BA；人血管内皮细胞株HMEC由法国国家卫生医学研究院惠赠；人肝癌细胞株Bel-7402，人鼻咽癌细胞株CNE；磺酰罗丹明B(SRB)，内皮细胞生长因子(EGF)；Matrigel；RPMI1640、MCDB-131培养基、胎牛血清；小牛血清；胰酶；细胞培养板。倒置显微镜；酶标仪；CO2培养箱。

1.2细胞培养Bel-7402细胞、CNE细胞用RPMI1640培养液(含10%小牛血清、1%双抗)培养，HMEC细胞用MCDB-131培养液(含10%小牛血清、1%双抗、1 mg/L氢化可的松、10 μg/L EGF)培养。培养箱设置条件为37 ℃、5%CO2。

1.3Bel-7402细胞和CNE细胞增殖、凋亡情况观察①细胞增殖情况：取对数生长期Bel-7402细胞、CNE细胞，分别接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，每个浓度设4个平行孔，培养过夜。铺Bel-7402细胞的96孔板中分别加入0、5、10、12、14、16、18、20、30 mg/L的BA，铺CNE细胞的96孔板中分别加入0、5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L的BA。培养72 h后去掉上清液，加入100 g/L三氯醋酸固定1 h后用去离子水洗5遍干燥。4 g/L SRB染色，室温放置30 min，用1%醋酸液洗5遍，加150 μL的10 mmol/L Tris(pH 10.5)溶解，酶标仪在波长531 nm测定吸光度。计算细胞增殖抑制率，抑制率(%)=[(1-实验组A值)/对照组A值]×100%。②细胞凋亡情况：取对数生长期Bel-7402细胞、CNE细胞，接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养24 h，后在Bel-7402细胞的96孔板中分别加0、5、10、20、40、60 mg/L的BA，CNE细胞的96孔板中分别加0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/L的BA，24 h后加Hochest33342和PI，其终浓度均为10 mg/L，培养10 min后，荧光显微镜观察细胞的形态并拍照。

1.4HMEC细胞增殖情况、迁移能力、血管形成能力观察①细胞增殖情况：取对数生长期HMEC细胞，分别接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，每个浓度设4个平行孔，培养过夜。铺HMEC细胞的96孔板中分别加入0、5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L的BA。培养72 h后去掉上清液，加入100 g/L三氯醋酸固定1 h后，用去离子水洗5遍干燥。4 g/L SRB染色，室温放置30 min，用1%醋酸液洗5遍，加150 μL的10 mmol/L Tris(pH 10.5)溶解，酶标仪在波长531 nm测定吸光度。计算细胞增殖抑制率，抑制率(%)=[(1-实验组A值)/对照组A值]×100%。②细胞迁移能力：取对数生长期HMEC细胞，以2×108/L的细胞接种于24孔板中，每孔2 mL，放置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。用剪平的枪头在铺有细胞的24孔板中间划线，培养液洗涤3次，洗去划下的细胞，分别加入0、6.25、12.5、25、50 mg/L的BA。72 h后，在倒置显微镜下观察并用显微镜拍照，Image Pro Plus6.0软件计算划痕区域细胞的面积。③细胞血管形成能力：实验材料先在4 ℃冰箱中预冷，取50 μL的Matrigel加入96孔培养板中，37 ℃孵育4 h待其凝固。分别取BA、含15%血清的MCDB-131培养液和HMEC细胞(4×104个/孔)混匀后加入到96孔培养板中，BA终浓度为0、6.25、12.5、25、50 mg/L。培养24 h，显微镜下观察血管形成。

1.5统计学方法采用SPSS11.0统计软件。组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Bel-7402细胞、CNE细胞增殖抑制率比较BA浓度为5、10、12、14、16、18、20、30 mg/L时，Bel-7402细胞增殖抑制率分别为0.5%、5.0%、28.9%、43.0%、58.8%、76.3%、86.2%、93.1%。BA浓度为5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L时，CNE细胞增殖抑制率分别为51.7%、72.7%、78.5%、90.0%、92.7%、93.6%、95.0%、95.3%。BA对Bel-7402细胞和CNE细胞的增殖有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性(P均<0.05)。

2.2Bel-7402细胞、CNE细胞凋亡率比较Bel-7402细胞分别加入0、5、10、20、40、60 mg/L的BA，其凋亡率分别为8.0%、11.2%、24.0%、67.2%、82.4%。CNE细胞分别加入0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/L的BA，其凋亡率分别为1.6%、4.9%、6.1%、11.1%、59.9%。BA对Bel-7402细胞和CNE细胞的凋亡有明显的促进作用，且呈剂量依赖性(P均<0.05)。

2.3HMEC细胞增殖抑制率比较BA浓度为5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L时，Bel-7402细胞增殖抑制率分别为27.4%、55.9%、61.7%、69.5%、73.7%、78.2%、78.3%、79.1%，BA对HMEC细胞增殖有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性(P均<0.05)。

2.4HMEC细胞迁移能力比较BA浓度为6.25、12.5、25、50 mg/L时，HMEC细胞迁移抑制率分别为3.7%、12.7%、13.0%、18.2%。BA对HMEC细胞迁移能力有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性(P均<0.05)。

2.5HMEC细胞血管形成能力比较加入0 mg/L BA的HMEC细胞形成了典型的细胞网络，内皮细胞之间排列有序，组成一个个环状管腔结构；而加入6.25 mg/L BA时，血管形成受到抑制；当BA浓度提高到12.5 mg/L时，内皮细胞小管不能形成完整的环状结构；BA浓度为50 mg/L时，内皮细胞几乎无移动，也不能形成管状结构。

3讨论

1971年，Folkman[8,9]首次提出肿瘤生长依赖于新血管生成的假说，后来随着毛细血管内皮细胞培养技术的研究和血管生成剂的发现，肿瘤血管成为肿瘤治疗的新靶点。肿瘤的生长从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，血管生成使肿瘤细胞获得足够营养物质而快速增殖，寻找一种能抑制肿瘤侵袭、转移、血管生成的药物成为肿瘤研究的热点。中药是我国的传统医药库，在肿瘤治疗方面有独特的优势。BA是一种从白桦树树皮中提取的醇类化合物，能抑制上皮细胞和黑色素瘤细胞的增殖，对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，是一个非常有前途的新化疗药物。Damle等[10]报道，BA能抑制MCF-7细胞的增殖、迁移，其IC50为13.5 mg/L，可延迟模型鼠肿瘤的形成。也有学者报道[11]，BA通过线粒体膜电位下降以及上调死亡受体等诱导了多种肿瘤细胞的凋亡。本研究显示，BA在体外不仅抑制Bel-7402细胞、CNE细胞增殖，并诱导细胞凋亡，且呈明显的剂量依赖性。肿瘤细胞的迁移活性是评价肿瘤恶化程度的最重要生物学指标之一，也是影响肿瘤治疗效果和预后判断的重要因素[12]，因此抑制肿瘤的迁移是治疗肿瘤的关键。本研究显示，BA在体外抑制了HMEC细胞的增殖和迁移，而且随BA浓度增加，其抑制作用增强。

Matrigel是一种由EHS小鼠肉瘤细胞分泌，富含各种促进血管新生因子的细胞外基质，可提供三维空间环境，便于内皮细胞分化成类似新微血管网状的管腔，模拟血管新生作用的过程。Matrigel实验表明，BA能抑制内皮细胞管腔的形成，从而为诱导肿瘤细胞凋亡、死亡及抑制肿瘤组织血管生成提供了有力佐证。我们前期实验[13]曾报道23-羟基白桦酸对HMEC细胞的作用，证实其有明显体外抗血管生成作用。本研究说明，BA也同样具有体外抗血管生成作用，且抑制效果比23-羟基白桦酸更明显。因此，BA体外可显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，并且减弱细胞的迁移及抗血管生成的作用，其有可能成为一个具有较好应用前景的抗肿瘤血管生成药物。

参考文献：

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[3] 蒋孟军,周尧远,杨敏,等.白桦酸对人胰腺癌细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡的影响[J].中国中药杂志,2010,35(22):3056-3059.

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Effects of Betulinic acid in vitro on proliferation and angiogenesis of human hepatocellular carcinoma cells and nasopharyngeal carcinoma cells

HUANGHeyun1,ZHOUYaoyuan,ZHANGRongjun,CAIGangming,GUXiaobo,PANDonghui,JIANGMengjun

(1JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Jiangsu214063,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of Betulinic acid (BA) in vitro on the proliferation and angiogenesis of tumor cells. MethodsThe human hepatocellular carcinoma cells (Bel-7402), human nasopharyngeal carcinoma cells (CNE) and human microcapillary endothelial cells (HMEC) were intervened by different concentrations of BA. The proliferation inhibition rates and apoptosis rates of Bel-7402 cells and CNE cells were compared. In addition, the proliferation inhibition rate, migratory ability and angiogenesis of HMEC cells were compared.Results BA inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of Bel-7402 cells and CNE cells, which were in a dose-dependent manner (all P<0.05). BA also inhibited the proliferation and reduced the migratory ability and angiogenesis with a dose-dependent manner (all P<0.05).ConclusionBA can inhibit the proliferation and angiogenesis of human hepatocellular carcinoma cells and human nasopharyngeal carcinoma cells.

Key words:Betulinic acid; human hepatocellular carcinoma cells; human nasopharyngeal carcinoma cells; human vascular endothelial cells

(收稿日期:2015-09-13)

中图分类号：R979.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)03-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.002

通信作者简介：蒋孟军(1972-)，男，本科，副研究员，主要研究方向为细胞生物学与核医学。E-mail： jmj16888@126.com

作者简介：第一黄荷云(1974-)，女，大专，主管药师，主要研究方向为药学。E-mail： whyjzx@126.com

基金项目：江苏省卫生厅基金资助项目(H200735)。