巴豆生物碱对肺腺癌细胞凋亡的影响及机制研究

武　晓　　刘凤娟　　王鹏飞　　张春玲青岛大学医学院第二附属医院呼吸科，山东青岛　266042



巴豆生物碱对肺腺癌细胞凋亡的影响及机制研究

武晓刘凤娟王鹏飞张春玲
青岛大学医学院第二附属医院呼吸科，山东青岛266042

[摘要]目的研究巴豆生物碱（CA）对肺腺癌细胞（A549）增殖和凋亡的影响，推测其抗肺癌作用机制。方法体外培养肺腺癌细胞（A549）。用终浓度分别为0（对照组）、10、50、100μg/mL的CA组处理A549细胞24 h后，于相差显微镜下观察细胞的一般形态结构、脱落情况等；MTT法检测细胞的生长活性；流式细胞仪检测细胞凋亡率；酶联免疫法（ELISA）和RT-PCR法检测凋亡相关蛋白及基因Bcl-2、Bax的表达。结果10、50、100μg/mL的CA均能抑制A549细胞增殖，其抑制率与作用剂量相关。流式细胞术检测显示不同剂量CA作用于A549细胞24 h后，100μg/mL的CA可引起细胞凋亡，其余剂量未见凋亡；100μg/mL的CA组细胞凋亡率为（45.940±0.031）%，对照组细胞凋亡率为（3.450±0.012）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。ELISA提示不同剂量CA作用于A549细胞24 h后，100μg/mL的CA组促凋亡蛋白Bax为8.940±0.211，较对照组（4.450±0.131）表达增加；抑凋亡蛋白Bcl-2为4.860±0.132，较对照组（7.390±0.181）表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。RT-PCR显示100μg/mL的CA组Bax mRNA为6.881±0.611，较对照组（3.417±0.461）表达增加；Bcl-2 mRNA为2.812±0.342，较对照组（4.243± 0.731）表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论CA能抑制A549细胞的生长并促进其凋亡，其发生与Bax蛋白及基因的表达上调和Bcl-2蛋白及基因的表达下调有关。CA抗肺癌的作用机制可能通过Bax/Bcl-2途径促进肿瘤细胞凋亡，从而为临床治疗肺癌提供新的思路和途径。

[关键词]巴豆生物碱；肺腺癌；凋亡；作用机制

近年来，大家开始对巴豆及其提取物的抗肿瘤作用进行研究。巴豆生物碱（crotonic alkaloids，CA）具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。巴豆是一种流传于民间，用于抗癌的中草药偏方，为大戟科植物巴豆的干燥成熟种子，可生用、炒焦用或制霜用。民间早已应用巴豆的提取物治疗恶性肿瘤，其提取物对胃癌、肝癌及甲状腺癌等多种肿瘤均具有治疗作用，其能缓解晚期胃癌患者的症状，减慢病程的进展，减少转移。相关文献资料关于CA抗癌作用机制的研究甚少，鲜有报道。查阅国内外文献，CA对于胃癌、卵巢癌、肠癌等均有抗癌作用，但尚未见有关抗肺癌作用的报道。本实验采用体外肺癌细胞培养，研究CA对肺癌细胞（A549）增殖和凋亡的影响，初探CA对肺癌的治疗作用及有效作用机制。

1　材料与方法

1.1试剂与耗材

肺腺癌细胞株（A549细胞）取自青岛市中心医院肿瘤生物治疗中心。

DMEM培养液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；DMSO（美国Hyclone公司）；流式细胞术所需材料（中国森雄公司）；RNAiso Reagent（购自Takara公司）；琼脂糖、DNA Marker 2000、氯仿、异丙醇（上海生物工程有限公司）；Loading Buffer（大连宝生物工程有限公司）；内参GAPDH cDNA引物序列；Bax、Bcl-2引物序列（上海生物工程有限公司合成）；逆转录试剂盒及PCR试剂盒（购自Fermentas中国公司）；巴豆生物碱。

Bax：GAGGAACTGGACAGTAACATGGAGCT；CGGCCCCAGTTGAAGTTGC。Bcl-2：GCCGGTTCAGGTACTCAGTCATC；GTCACCTTCACCGTTCCA。GAPDH：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC；ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

1.2试验方法

体外培养肺腺癌细胞（A549）。用终浓度分别为0（对照组）、10、50、100μg/mL的CA组处理A549细胞24 h后，于相差显微镜下观察细胞的一般形态结构、脱落情况等；MTT法检测细胞的生长活性；流式细胞仪（AnnexinV-PI染色）检测细胞凋亡率；酶联免疫法（ELISA）和RT-PCR法检测凋亡相关蛋白及基因Bcl-2、Bax的表达。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MTT法检测不同剂量CA对A549细胞活性的影响

不同剂量CA作用于A549细胞24 h后，对细胞活性均具有显著抑制作用，随着药物浓度增加，细胞活性受抑制逐渐增加，表现为剂量依赖关系。见表1。

表1　不同剂量CA对A 5 4 9细胞活性的影响（?s）

2.2倒置相差显微镜下A549细胞形态学观察

对照组A549细胞生长状态良好，漂浮细胞较少，胞浆丰富，胞核清晰可见，呈多角形，细胞排列不紧密，细胞间可见相互连接（图1A）。CA组：10μg/mL的CA干预A549细胞24 h后，大部分贴壁细胞有完整的胞核和胞浆，小部分细胞皱缩成球（图1B）；50μg/mL的CA干预A549细胞24 h后，可见许多漂浮细胞，贴壁细胞少见有完整的胞核和胞浆，大部分细胞呈齿轮形状，并且部分细胞皱缩成球（图1C）；100μg/mL的CA干预A549细胞24 h后，可见大量漂浮细胞，贴壁细胞几乎无完整的胞核和胞浆，大部分细胞皱缩成球，已无正常细胞形态（图1D）。

图1　不同剂量CA干预A 5 4 9细胞的倒置相差显微镜下表现（1 0 0×）

2.3AnnexinV-PI染色检测不同剂量CA对细胞凋亡的影响

100μg/mL的CA作用于A549细胞后24 h细胞凋亡率与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

注：与对照组比较，*P＜0.05；CA：巴豆生物碱

与对照组比较，100μg/mL的CA组抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余剂量CA组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3　不同剂量CA对A 5 4 9细胞Bc l-2、Ba x蛋白表达的影响（±s）

表3　不同剂量CA对A 5 4 9细胞Bc l-2、Ba x蛋白表达的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；CA：巴豆生物碱

组别　　剂量（μg/mL）　Bcl-2　Bax对照组CA组0 10 50 100 7.390±0.181 6.980±0.139 6.250±0.171 4.860±0.132*4.450±0.131 4.250±0.112 5.270±0.251 8.940±0.211*

2.5RT-PCR法检测不同剂量CA对A549细胞Bcl-2、BaxmRNA表达的影响

与对照组比较，100μg/mL的CA组Bcl-2mRNA表达减少，Bax mRNA表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余剂量CA组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4　不同剂量CA对A5 4 9细胞Bc l-2、Ba xm RNA表达的影响（±s）

表4　不同剂量CA对A5 4 9细胞Bc l-2、Ba xm RNA表达的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；CA：巴豆生物碱

组别　　剂量（μg/mL）　Bcl-2mRNA　BaxmRNA对照组CA组0 10 100 4.243±0.731 4.152±0.671 2.812±0.342*3.417±0.461 4.215±0.422 6.881±0.611*

3　讨论

肺癌在中医古代文献中属于肺疾、肺痈。肺癌的主要发病机制是正气不足和邪气入侵，其次为痰瘀。若正气不足和阴阳失衡将会引起病原体火癌症毒素入人的肺部[1]。肺功能差将会导致肺气阻塞、弥散损伤和弥散功能下降，血流停滞，干扰液体分布。体液累积导致的痰液凝固，从而导致气血停滞和血瘀。气滞血瘀和痰液、毒素积累逐渐导致肺功能损伤[2]。肺癌是一种全身性疾病。肺虚通常表现为气虚、阴虚和气血不足。

当西医治疗不能提供任何其他的治疗方案时，中医药常作为缓解终末期肿瘤症状辅助治疗手段[3]。然而，中医药能在肿瘤的整个过程中发挥重要的预防和治疗作用。众多研究资料表明，天然植物中存在具有治疗价值的抗癌成分[4]，中药复方阿胶浆可显著提高小鼠在化疗和放疗后的造血功能[5]。八珍汤能降低恶性卵巢瘤患者接受化疗后的胃肠道反应、白细胞减少、腹膜炎等和肝肾功能的发生率[6]。四种中草药植物（白花蛇舌草、党参、地黄、黄芪）影响CYP3A4的活性和表达，其能够有助于抗癌药物的代谢[7]。临床上，中药可以提高放疗患者的生存率并改善生活质量，并能减少放疗的毒性，如放射性炎症、白细胞缺陷和免疫功能紊乱。近年来，中医药一直是一个公认有效的生物反应调节剂，可以调节肿瘤患者的非特异性免疫功能，缓解化疗或放疗不良反应[8]。一些中药制剂，如华蟾素注射液、艾迪注射液及参芪扶正胶囊早已被证明作为辅助支持治疗肿瘤具有良好的作用，其可以减弱放化疗带来的毒副作用，同时提高疗效[9]。因此，中医与现代相结合药物化疗和放疗等每一个阶段的治疗可以明显减轻临床症状，改善生活质量，延长预期寿命[10]。这种治疗模式不仅较单独使用现代医学有显著优势，也是多学科综合疗法的趋势[11]。最近的研究基于中医基础理论，应用中西医综合治疗放化疗引起的毒副作用。如何从天然植物中特别是传统中药中寻找和筛选出具有预防和治疗肿瘤的活性药物，已成为医学界关注的焦点。

巴豆是一种流传于民间，用于抗癌的中草药偏方，为大戟科植物巴豆的干燥成熟种子。可生用、炒焦用或制霜用。主产于南方地区如四川、广东、云南等地。全世界共有800多种，广泛分布于热带及亚热带等地区。其性味辛、热，有大毒。入胃、大肠、肺经。具有逐水退肿、泻下寒积、祛痰、蚀疮等多种功效。临床常用于便秘腹痛，体质壮实的水肿以及气急喘促、痰壅咽喉和疮脓熟而未破等证。该属植物的主要成分包括巴豆油、巴豆树脂、生物碱、毒性蛋白、巴豆苷等，民间早已应用巴豆的提取物治疗恶性肿瘤，其提取物对胃癌、肝癌及甲状腺癌等多种肿瘤均具有治疗作用[12-14]，其能缓解晚期胃癌患者的症状，减慢病程的进展，减少转移。

CA抗癌机制如下：①CA对膜系统分子动力学影响；②诱导肿瘤细胞凋亡[15-16]；③诱导肿瘤细胞分化、逆转[17]；④改变细胞胞浆结构，破坏癌细胞微管[18-20]。本研究结果显示，10、50、100μg/mL的CA均能抑制A549细胞增殖，其抑制率与作用浓度相关；流式细胞术检测结果显示，不同剂量CA作用A549细胞24 h后，只有100μg/mL的CA可引起细胞凋亡，其余剂量未见凋亡，多为坏死细胞；100μg/mL的CA组的细胞凋亡率与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；ELISA结果提示，不同剂量（0、10、100μg/mL）CA作用A549细胞24 h后，与对照组比较，100μg/mL 的CA组促凋亡蛋白Bax表达增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05），其余剂量CA组差异无统计学意义（P＞0.05）；RT-PCR结果显示，100μg/mL的CA组BaxmRNA表达增加，Bcl-2mRNA表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05），其余剂量CA组差异无统计学意义（P＞0.05）；由结果推测CA能抑制A549细胞的生长并促进其凋亡，其发生与Bax蛋白及基因的表达上调和Bcl-2蛋白及基因的表达下调有关。

本研究发现，CA能抑制肺腺癌（A549细胞）的生长并促进其凋亡，其发生与Bax蛋白及基因的表达上调和Bcl-2蛋白及基因的表达下调有关。CA抗肺癌的作用机制可能主要通过Bax/Bcl-2途径促进肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗作用。那么CA作为一种中药，可以治疗肺癌，同时提示可能通过针对作用于Bcl-2家族蛋白，Bax/Bcl-2途径作为靶向途径，起到治疗作用，为临床治疗肺癌提供了一种新的临床思路。

[参考文献]

[1]郁仁存.中医药防治肿瘤的作用和展望[J].中国中西医结合杂志，2007，27（5）：389-390.

[2]Xie J，Shao J，Lu Y，et al.Separation of ginseng active ingredients and their roles in cancer metastasis supplementary therapy[J].Curr Drug Metab，2013，14（5）：616-623.

[3]林举择，王昌俊.肿瘤术后复发转移的策略[J].广东医学，2013，34（1）：157-158.

[4]Meng MB，Wen QL，Cui YL，et al.Meta-analysis：traditional Chinesemedicine for improving immune response in patients with unresectable hepatocellular carcinoma after transcatheter arterial chemoembolization[J].Explore（NY），2011，7（1）：37-43.

[5]Liu M，Tan H，Zhang X，et al.Hematopoietic effects and mechanisms of Fufang Ejiao Jiang on radiotherapy and chemotherapy-induced myelosuppressed Mice[J].JEthnopharmacol，2014，152（3）：575-584.

[6]苏新华.八珍化积汤联合化疗治疗28例卵巢癌临床观察[J].内蒙古中医药，2013，32（35）：57，76.

[7]Lau C，Mooiman KD，Maas-Bakker RF，etal.Effectof Chinese herbs on CYP3A4 activity and expression in vitro[J]. JEthnopharmacol，2013，149（2）：543-549.

[8]Tas D，Uncu D，Sendur MA，et al.Acupuncture as a complementary treatment for cancer patients receiving chemotherapy[J].Asian Pac JCancer Prev，2014，15（7）：3139-3144.

[9]Meng Z，Garrett CR，Shen Y，et al.Prospective randomised evaluation of traditional Chinese medicine combined with chemotherapy：a randomised phaseⅡstudy of wild toad extract plus gemcitabine in patients with advanced pancreatic adenocarcinomas[J].Br JCancer，2012，107（3）：411-416.

[10]Guo H，Liu JX，Xu L，et al.Traditional Chinesemedicine herbal treatment may have a relevant impact on the prognosis of patients with stageⅣadenocarcinoma of the lung treated with platinum-based chemotherapy or combined targeted therapy and chemotherapy[J].Integr Cancer Ther，2011，10（2）：127-137.

[11]Li X，Yang G，Li X，et al.Traditional Chinese medicine in cancer care：a review of controlled clinical studies published in Chinese[J].PLoSOne，2013，8（4）：e60338.

[12]朱均，吴智南，徐卫东，等.巴豆生物碱对人骨肉瘤细胞细胞周期凋亡及对Bcl-2基因表达的影响[J].中华中医药学刊，2009，27（7）：1450-1452.

[13]许群，方轶萍，赵小迎，等.巴豆生物碱上调TRAIL配体、caspase-8的表达诱导HeLa细胞凋亡的体外研究[J].海峡药学，2011，23（2）：179-184.

[14]许群，方轶萍，赵小迎，等.巴豆生物碱诱导HeLa细胞凋亡及其作用机制[J].中国生化药物杂志，2010，31（6）：392-395.

[15]Deng LJ，Hu LP，Peng QL，et al.Hellebrigenin induces cell cycle arrest and apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells through inhibition of Akt[J]. Chem Biol Interact，2014，219（10）：184-194.

[16]Wang H，Wu C，Wan S，et al.Shikonin attenuates lung cancer cell adhesion to extracellularmatrix and metastasis by inhibiting integrinβ1 expression and the ERK1/2 signaling pathway[J].Toxicology，2013，308（10）：104-112. [17]Chen H，Shen A，Zhang Y，et al.Pien Tze Huang inhibits hypoxia-induced epithelialmesenchymal transition in human colon carcinoma cells through suppression of the HIF-1 pathway[J].Exp TherMed，2014，7（5）：1237-1242. [18]Chen Y，Zheng L，Liu J，et al.Shikonin inhibits prostate cancer cells metastasis by reducing matrix metalloproteinase-2/-9 expression via AKT/mTOR and ROS/ERK1/ 2 pathways[J].Int Immunopharmacol，2014，21（2）：447-455. [19]Zhang J，Wang P，Ouyang H，et al.Targeting cancer-related inflammation：Chinese herbalmedicine inhibits epithelial-to-mesenchymal transition in pancreatic cancer[J]. PLoSOne，2013，8（7）：e70334.

[20]贾冰，叶丽红.中医药抗肿瘤转移机制研究进展[J].肿瘤防治研究，2013，40（6）：620-623.

Influence and mechanism study of crotonic alkaloids on apoptosis of lung adenocarcinoma cell

WU Xiao LIU Fengjuan WANG Pengfei ZHANG Chunling
Department of Respiration,the Second Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Shandong Province, Qingdao 266042,China

[Abstract]Objective To confer themechanism of action through researching the effect of the croton alkaloids(CA)on proliferation and apoptosis of lung adenocarcinoma cells(A549).M ethods The A549 cells were exposed into CA at various doses(0,10,50,100μg/mL)for 24 h.Themorphology and growth feature of the A549 cellswere observed by the phase contrastmicroscope.The cell growth activity was detected through the MTTmethod.The cell apoptosis rate was detected by the flow cytometry instrument.The expression of gene Bcl-2 and Bax were detected through the ELISA and RT-PCR methods.Results The doses of 10,50,100μg/mL could inhibit the A549 cells proliferation,the inhibition ratio was correlated with concentration.Different doses CA on A549 cells after 24 h,the result of flow cytometry test showed that only CA group(100μg/mL)could induce cell apoptosis,the other dose was not apoptosis.The apoptosis rate of CA group(100μg/mL)was(45.940±0.031)%,the apoptosis rate of control group was(3.450±0.012)%,the difference between two groupswas significant(P＜0.05).Different doses of CA on A549 cells after 24 h,the result of ELISA showed that pro-apoptotic protein Bax of CA group(100μg/mL)was 8.940±0.211,express increased than that of control group(4.450±0.131);suppression of apoptosis protein Bcl-2 of CA group(100μg/mL)was 4.860±0.132,express decreased than that of control group(7.390±0.181),the differences between two groups were significant(P＜0.05).RT-PCR showed that Bax mRNA of CA group(100μg/mL)was 6.881±0.611,express increased than that of control group(3.417±0.461);Bcl-2 mRNA of CA group(100μg/mL)was 2.812±0.342,express decreased than that of control group(4.243±0.731),the differences between two groupswere significant(P＜0.05).Conclusion CA can inhibit the A549 cells growth and promote its apoptosis which through up-regulated the Bax gene and down-regulated the Bcl-2 gene.CA may through regulate the Bax/Bcl-2 gene induced apoptosis,which may provide new approaches for clinical treatment of lung cancer.

[Key words]Crotonic alkaloids;Lung adenocarcinoma;Apoptosis;Mechanism of action

收稿日期：（2015-07-20本文编辑：李亚聪）

[通讯作者]张春玲（1966.5-），女，主任医师；研究方向：肺癌，哮喘，危重症医学。

[作者简介]武晓（1980.12-），男，硕士；研究方向：肺癌，危重症医学。

[中图分类号]R734.2

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2016）01（a）-0017-04