急性髓细胞性白血病基因表达特点分析

王　洁　　叶　芳　　李国霞　　乔振华　　马东升.山西医科大学第二医院血液科，山西太原　03000；.清华大学附属北京市垂杨柳医院血液科，北京　000



急性髓细胞性白血病基因表达特点分析

王洁1叶芳2李国霞1乔振华1马东升1
1.山西医科大学第二医院血液科，山西太原030001；2.清华大学附属北京市垂杨柳医院血液科，北京100022

[摘要]目的探讨急性髓细胞性白血病（AML）患者的基因表达特点及临床意义。方法选取2014年3月～2015年1月山西医科大学第二医院收治的94例初发AML患者，采用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）方法检测WT1、P53、DNMT3A、NPM1、PML/RARa、FLT3-ITD、C-KIT、AML1/ETO、TET2、ASXL1基因的表达情况。结果AML患者（急性早幼粒细胞白血病除外）中WT1阳性最常见（69.1%），其次为AML1/ETO阳性（24.5%）、NPM1阳性（14.9%）、FLT3-ITD突变阳性（14.9%）；其中，1个基因阳性者最常见，占46.8%，2个基因阳性者占28.7%，3个及以上基因阳性者占20.2%；DNMT3A、NPM1多表达于AML-M4，C-KIT、AML1/ETO阳性多见于AML-M2；APL患者PML/RARa融合基因占100%，其中同时FLT3-ITD突变者3例，占27.27%；94例AML患者中，65例WT1表达阳性，其中19例初诊阴性的患者在随访过程中随着WT1增高而呈复发或复发倾向；另外46例初发时WT1升高患者经诱导治疗后34例获得第1次完全缓解或者部分缓解，并且WT1降低。结论基因表达在AML的诊断和疗效评估中起重要作用。[关键词]急性髓细胞性白血病；基因表达；诊断；预后

急性白血病（acute leukemia，AL）是造血干细胞的恶性克隆性疾病，因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段，仅凭骨髓细胞形态学进行分型诊断，其准确率约占70%。随着分子生物学技术的迅速发展，基因

1　资料与方法

1.1一般资料

所有病例来自2014年3月～2015年1月山西医科大学第二医院血液科确诊为AML的住院患者。其

中，男48例，中位年龄58岁；女46例，中位年龄51岁。根据法、美、英分型系统（FAB）诊断标准将患者分为AML未分化型（AML-M1）2例、AML部分分化型（AML-M2）35例、急性早幼粒细胞白血病（APL）11例、急性粒-单核细胞白血病（AML-M4）29例、急性单核细胞白血病（AML-M5）5例、急性红白血病（AML-M6）8例、未定型的AML 4例。WT1基因检测时间：初诊治疗前；1个疗程标准方案诱导化疗后。

1.2方法

1.2.1提取DNA/RNA抽取抗凝骨髓2 mL，参照美国Qiagen公司全血基因提取试剂盒说明书，提取基因组DNA/RNA。

1.2.2引物设计引物从GeneBank检索基因序列，由北京奥科生物技术公司设计并合成，PAGE纯化。PCR扩增引物序列见表1。

表1　PCR扩增引物序列

1.2.3RT-PCR方法检测基因反应体系：10×buffer 2.5μL，25 mmol/L MgCl 21.5μL，10 mmol/L dNTP 0.5μL/L，20μmol/L引物，TaqDNA聚合酶1.5μL，模板DNA 4μL，加去离子液至总体积25μL。反应条件：94℃预变性3min，开始35个循环，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，72℃总延伸10 min。PCR产物凝胶电泳，用UVP凝胶成像分析系统（美国UVP公司）摄片或送上海基康生物技术有限公司纯化并进行测序分析。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料采用Wilcoxon秩和检验，相关性采用Spearman秩相关，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1检测结果

基因阳性电泳图见图1～4。

图1　PML/RARa电泳图

图2　AML 1/ETO电泳图

图3　FLT 3-I TD垂直胶电泳图

图4　NPM 1垂直胶电泳图

2.2AML患者各基因表达

融合基因表达由高到低依次为WT1、AML1/ETO、NPM1、FLT3-ITD、DNMT3A、PML/RARa、C-KIT、P53、TET2、ASXL1，可见WT1增高最常见，其次为AML1/ ETO突变，再次为NPM1、FLT3-ITD突变。目前为止尚无ASXL1突变阳性的患者。DNMT3A突变患者91.7%为AML-M4，NPM1突变患者57.1%为AMLM4，C-KIT突变患者77.7%为AML-M2，AML1/ETO突变患者91.3%为AML-M2，可见DNMT3A、NPM1突变多见于AML-M4患者，C-KIT、AML1/ETO突变多见于AML-M2患者。所有患者发生1个基因突变者占46.8%，2个基因突变者占28.7%，3个及以上基因突变者占20.2%，得出1个基因突变者最常见，其次为2个基因突变，3个及以上基因突变最少见。APL患者100%存在PML-RARa基因，27.3%的APL患者合并FLT3-ITD基因突变。见表2。

表2　9 4例AML患者融合基因表达的情况（例）

2.3初诊WT1增高患者诱导治疗后WT1的变化情况

初诊WT1阳性患者46例，诱导治疗后随访患者37例，其余9例因未复查WT1或复查后结果未回报亦或因某种原因放弃治疗而失访；初诊时WT1 （1720.73±2805.90）WT1/104*ABL拷贝数，诱导治疗后WT1（379.50±1165.76）WT1/104*ABL拷贝数，后者明显低于前者；随访患者中34例诱导治疗后获得完全缓解或者部分缓解，并且WT1减低，3例未缓解。采用Wilcoxon秩和检验得出Z=-4.32，差异有高度统计学意义（P＜0.01），说明治疗有效，WT1可以作为评价疗效的指标。

2.4初诊时WT1阴性患者随访过程中WT1值与复发的相关性

19例初诊WT1阴性患者诱导治疗后随访过程中WT1值升高，骨髓原始细胞百分比例显著增高，呈复发或复发倾向，采用Spearman秩相关检验，得出r= 0.48，P=0.014，差异有统计学意义。见图5。

图5　WT 1与复发关系的散点图

3　讨论

据有关文献报道NPM1、DNMT3A、FLT3-ITD突变多见于年轻、女性、骨髓原始细胞比例较高患者，DNMT3A为总体生存期的独立影响因子，小于60岁年轻患者同时存在三种基因突变，预后、无病生存期、总体生存期较差[1]。NPM1阳性多见于AML-M4、AML-M5[2]，FLT3-ITD在APL、正常核型AML患者中升高[3]。在非APL患者中，FLT3-ITD突变预示完全缓解率和总生存期明显缩短[4]。FLT3-ITD、C-KIT均是与发病相关的酪氨酸激酶，索拉菲尼是一种多靶点激酶抑制剂，已成为一种非常有前景的药物。本研究得出27.3%的APL患者合并FLT3-ITD基因突变，此结果与文献一致[5]；但本研究NPM1多见于AML-M4患者，仅有2例表达于AML-M5，与相关文献有所不同[6-7]，可能与随访时间短、病例数少有关。

相关文献报道WT1基因突变提示预后不良，无病生存期、总体生存期缩短[8]。AML患者WT1阳性表达率为76.9%，表达水平在各亚型间差异：AML-M1表达居最高水平，APL相对较低。复发高峰期平均在2.5个月，WT1水平多数再上升10～100倍[9]。本研究显示WT1阳性表达率为69.1%，但AML-M2表达居最高水平，可能与AML-M2患者数量较多有关。

PubMed有文献报道ASXL1多见于老年、男性、继发急性髓细胞白血病、骨髓原始细胞百分比例较低的患者，与NPM1、FLT3-ITD、DNMT3A呈负相关性，ASXL1突变患者具有低完全缓解率、短无事件生存期，高死亡率，尤其合并RUNX1突变提示预后不良[10]。本研究尚无ASXL1突变患者，考虑可能与收集病例数少、ASXL1阳性率低有关。

1973年Rowley等[11]第1次提出t（8；21）（q22；q22）染色体易位，产生特异性的AML1/ETO融合基因，AML-M2中其发生率可高达40%～80%[12]。2001年世界卫生组织（WHO）将伴有t（8；21）（q22；q22）AML1/ ETO的AML定义为独立亚型，可诊断为t（8；21）AML[13]。其定量检测是监测微小残留病的一个敏感指标[14]，拷贝数的高低与治疗、缓解率及复发相关[15]。在危险分层中AML1/ETO阳性往往被认为是预后较好的类型；但同时有高白细胞、髓外浸润、附加染色体异常等[16]高危因素的患者，虽然化疗可取得一定的疗效[17]，但是异基因造血干细胞移植比单纯化疗有较好的长期生存率。AML1/ETO阳性的患者C-KIT D816V和N822K突变常见，预后差，骨髓原始细胞比例较高，C-KIT基因突变检测对治疗和预后有重要意义[18]。

TET2在白血病发生中主要表现为抑癌基因功能，可抑制造血干细胞/祖细胞（hematopoietic stem cell/progenitor cell，HSPC）异常自我更新，其功能丢失时可能参与疾病发生。TET2突变的患者预后不良，与无事件生存率、缓解率呈负相关[19]，并常合并DNMT3A和JAK2等基因的突变，提示白血病形成的不同阶段[20]。

[参考文献]

[1]LoghaviS，ZuoZ，RavandiF，etal.Clinical featuresofDeNovo acute myeloid leukemia with concurrent DNMT3A，FLT3 and NPM1mutations[J].Hematol Oncol，2014，7（1）：74.

[2]Gale RE，Green C，Allen C，et al.The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level，number，size and interaction with NPM1mutations in a large cohort of young adult patients with acute myelaid leukemia[J].Blood，2008，111（5）：2776-2784.

[3]Small D.FLT3mutation：biology and treatment[J].Hematology Am Sac Hematol Educ Program，2006，2006（1）：178-184.

[4]朱化超，贺鹏程，程小岩，等.FLT3-ITD基因在急性髓细胞白血病患者中的突变及对预后影响分析[J].临床血液学杂志，2015，28（5）：392-395.

[5]Man CH，Fung TK，Ho C，et al.Sorafenib treatment of FLT3-ITD（+）acute leukemia：favorable initial outcome and mechanisms of subsequent non responsiveness associated with the emergence of a D835 mutation[J].Blood，2012，119（6）：5133-5143.

[6]Sammons SL，Pratz KW，Smith BD，et al.Sorafenib is tolerable and improves clinical outcomes in patients with FLT3-ITD acute leukemia prior to stem cell transplant and after relapse post-transplant[J].Am JHematol，2014， 89（3）：936-938.

[7]Baker SD，Zimmerman EL，Wang YD，et al.Emergence of polyclonal FLT3 tyrosine kinase domain mutations during sequential therapy with Sorafenib and sunitinib in FLT3-ITD-positive acute leukemia[J].Clin Cancer Res，2013，19（20）：5758-5768.

[8]Paschka P，MarcucciG，Ruppert AS，et al.Wilms'tumor 1 gene mutations independently predict poor outcome in adultswith cytogenetically normal acutemyeloid leukemia：a cancerand leukemiagroup Bstudy[J].ClinOncol，2008，26（28）：4595-4602.

[9]张团结，邓宽国，孙征，等.WT1基因在急性白血病患者中的表达及临床意义[J].中外医学研究，2014，12（20）：81-83.

[10]Paschka P，Schlenk RF，Gaidzik VI.ASXL1mutations in younger adult patients with acute myeloid leukemia：a study of the German-Austrian Acute Myeloid Leukemia Study Group[J].Haematologica，2015，100（3）：324-330.

[11]Rowley JD.Identification ofa translocationwith quinacrine fluorescence in a patient witII acute leukemia[J].Ann Geuet，1973，16（2）：109-112.

[12]Zhou GB，Kang H，Wang L，et al.Oridonin，aditerpenoid extracted from medicinal herbs targets AMl1-ETO fusion protein and shows potent antitumor activity with low adverse effects on t（801）leukemia invitro and in vivo[J]. Blood，2007，109（8）：3441-3450.

[13]程淑琴，谢伟成，谢碧霞，等.138例急性白血病MICM分型及预后分析[J].肿瘤基础与临床，2008，21（2）：158-160.

[14]玄风华，谢福源.讨论伴t（8；21）的急性髓系白血病的形态学改变[J].江西医学检验，2007，25（6）：634-636.

[15]苗雨青，陈子兴，何军，等.急性髓系白血病M2亚型患者的预后多因素分析[J].中华血液流变学杂志，2006，16（1）：87-89.

[16]赵杰，殷宇明，杨君芳，等.83例AML1/ETO阳性急性髓系白血病的分子生物学和临床特点分析[J].临床血液学杂志，2012，25（6）：341-344.

[17]Pallisgaard N，Hokland P，Riishoj DC，et al.Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia[J].Blood，1998，92（2）：574-588.

[18]符爽，胡延平，陈芳，等.伴ETO或CBFB阳性的急性髓细胞白血病患者C-KIT基因突变的检测及意义[J].现代肿瘤医学，2015，23（11）：1581-1584.

[19]王敬毅，郝建国，崔兴，等.TET2基因与白血病研究进展[J].浙江中西医结合杂志，2015，25（6）：622-624.

[20]KoM，RaoA.TET2：epigenetic safeguard forHSC[J].Blood，2011，118（17）：4501-4503.

Analysis of gene expression characteristics in acutem yeloid leukem ia

WANG Jie1YE Fang2LIGuoxia1QIAO Zhenhua1MA Dongsheng1
1.Department of Hematology,the Second Hospital of Shanxi Medical University,Shanxi Province,Taiyuan 030001, China;2.Department of Hematology,Beijing Chuiyangliu Hospital Affiliated to Tsinghua University,Beijing 100022, China

[Abstract]Objective To investigate the gene expression characteristics of acute myeloid leukemia(AML)and their clinical significance.M ethods Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect WT1, P53,DNMT3A,NPM1,PML/RARa,FLT3-ITD,C-KIT,AML1/ETO,TET2,ASXL1 gene expressions in 94 new diagnosed AML patients in the Second Hospital of Shanxi Medical University from March 2014 to January 2015.Results AML patients(except for acute promyelocytic leukemia)with WT1 positivewere themost common(69.1%),followed by AML1/ETO positive(24.5%),NPM1 positive(14.9%),FLT3-ITD positive(14.9%).Moreover,one gene positive patients were themost common(46.8%),2 gene positive patients accounted for 28.7%,3 ormore gene positive patients accounted for 20.9%.Furthermore,DNMT3A,NPM1 expressedmore in AML-M4.C-KIT,AML1/ETO expressed more in AMLM2.PML/RARa fusion genewas 100%in APL patients,and 3 patientswith FLT3-ITDmutation,accounted for 27.27%. Among all 94 AML patients,WT1 gene expression was positive in 65 patients.19 new diagnosed AML patients whose WT1 were negative showed recurrence or tendency of recurrence with the increase ofWT1 in the follow-up process.In 46 new diagnosed AML patientswhoseWT1 gene expressionswere positive transfered to negativewhen 34 cases among these patients got complete remission or partial remission after inductive chemotherapy,and WT1 was decreased.Conclusion Gene expression plays an important role in the diagnosis and effect evaluation of acutemyeloid leukemia.

[Key words]Acutemyeloid leukemia;Gene expression;Diagnosis;Prognosis

收稿日期：（2015-08-20本文编辑：张瑜杰）

[通讯作者]叶芳（1973.9-），女，博士，副主任医师，硕士研究生导师；研究方向：恶性血液病的诊断与治疗。检测和微小残留病灶监测对AL的诊断、分型、治疗方案的选择和疗效评估具有重要意义。本研究总结了94例初发急性髓细胞性白血病（AML）患者的基因表达情况，并对其特点进行分析，探讨其临床意义，现报道如下：

[作者简介]王洁（1989.8-），女，硕士；研究方向：恶性血液病的诊断与治疗。

[中图分类号]R733.71

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2016）01（a）-0013-04