参附注射液对阿霉素所致心衰大鼠氧化应激水平及血管紧张素Ⅱ的影响

张志刚　　孙国栋　　常文华　　陈建忠山东省聊城市人民医院药学部，山东聊城　252000



参附注射液对阿霉素所致心衰大鼠氧化应激水平及血管紧张素Ⅱ的影响

张志刚孙国栋常文华陈建忠▲
山东省聊城市人民医院药学部，山东聊城252000

[摘要]目的探讨参附注射液对阿霉素（ADR）所致心衰大鼠氧化应激水平及血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ）的影响。方法将90只大鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、卡托普利组（作为阳性对照），参附注射液低、中、高剂量组，每组各15只。正常对照组仅给予等体积生理盐水，模型组于实验开始后第2、4天腹腔注射ADR 1mg/kg，第6、8天腹腔注射ADR 2mg/kg，第10、12天腹腔注射ADR 3mg/kg，第14、16天腹腔注射ADR 4mg/kg，累计用药剂量达20mg/kg。卡托普利组于实验开始后第5天卡托普利180mg/（kg·d）灌胃。参附组于造模后1周，按低、中、高剂量组分别腹腔注射参附注射液1、2、4mL/kg，每日1次，共2周。处理结束后测定心肌超氧化物歧化酶（SOD）活力和心肌丙二醛（MDA）含量；测定血清中AngiotensinⅡ水平。光镜观察心肌病理形态学变化；电镜观察心肌超微结构变化。结果阿霉素能显著降低大鼠心肌SOD活性，卡托普利、4mL/kg参附注射液可将心肌中SOD活性升高至（125.26±7.21）、（128.44±10.02）U/L，与模型组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）；ADR也提高了大鼠心肌MDA含量和血清AngiotensinⅡ水平,而给予卡托普利、4mL/kg参附注射液处理后，大鼠心肌中MDA含量分别降至（8.82±0.16）、（8.48±0.28）nmol/mg，血清AngiotensinⅡ水平降至（388.32±6.88）、（395.21±10.02）ng/L，与模型组比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01），而且心肌的病理学形态有了很大改善。结论参附注射液可明显改善心衰大鼠的心功能，保护机制可能与抗氧化及降低AngiotensinⅡ的含量有关。

[关键词]参附注射液；阿霉素；血管紧张素Ⅱ；心力衰竭；超氧化物歧化酶

心力衰竭是指心脏结构或功能性疾病导致心室充盈或射血能力减弱而引起的临床综合征，发病率和病死率居高不下，其发生机制尚未完全明确[1]。阿霉素（Adriamycin，ADR）是一种对包括白血病在内的多种恶性肿瘤具有抑制作用的蒽环类抗生素,临床应用广泛，但其剂量依赖性的心脏毒性限制了临床应用[2-3]。如何利用有关药物既发挥ADR抗肿瘤作用，又防止其心脏损害具有重要意义。近年来，某些药用植物在心血管疾病的预防过程中具有一定的预防作用[4]。参附注射液具有抗氧化、清除自由基等作用,对心血管具有良好的保护作用[5-6]。本实验利用大鼠建立ADR心力衰竭模型，通过检测大鼠血液中的血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ）含量和病理组织学变化，探讨参附注射液对ADR心力衰竭的保护作用及其机制。

1　材料与方法

1.1实验仪器与试剂

UV751GD紫外/可见分光光度计（上海分析仪器厂）；TDK-4离心机（上海安亭科学仪器制造厂）；JEM-1200EX透射电子显微镜（日本电子公司）。参附注射液（四川雅安三九药业有限公司，10 mL/支，批号：Z2004-3117）；注射用盐酸ADR（浙江海正药业股份有限公司，10 mg/瓶，批号：130702）；AngiotensinⅡ免疫试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2实验分组

清洁级SD大鼠90只，雌雄不限，体重250～280 g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2006-0009。大鼠实验前适应性喂养14 d。大鼠随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组（阳性对照）、参附注射液低剂量组、中剂量、高剂量组，每组15只。正常对照组：实验处理同模型组，腹腔注射等剂量0.9%氯化钠溶液；模型组：参考文献[6]方法，于实验开始后第2、4天腹腔注射ADR 1mg/kg，第6、8天腹腔注射ADR 2mg/kg，第10、12天腹腔注射ADR 3mg/kg，第14、16天腹腔注射ADR 4mg/kg，第16天累计用药剂量达20 mg/kg；卡托普利组：于实验开始后第5天卡托普利180mg/（kg·d）灌胃。参附注射液各剂量组：造模后1周，按低、中、高剂量组分别每次腹腔注射参附注射液1、2、4mL/kg，每日1次，共2周。

1.3左室重量指数的测定

末次给药24 h，取大鼠动脉血，分离血清备用。然后处死大鼠，取出心脏，洗净后迅速分离左心室（含室间隔），滤纸吸干水分，电子天平称重（单位为mg），计算左室重量指数。左室重量指数（LVMI，译）=左室质量/体重（LVW/BW）×1000译。

1.4心肌细胞形态学变化

取心室部分以10%甲醛固定，乙醇脱水后浸蜡包埋，HE染色，光镜下观察；取心尖部米粒大小心脏，2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，磷酸盐缓冲液清洗，制成超薄组织切片50 nm，铅铀染色，透射电镜观察心肌细胞超微结构。

1.5心肌SOD活力和心肌MDA含量测定

取心室部分，用生理盐水制备心脏匀浆，1500 r/min离心10min，硫代巴比妥酸显色法测定心肌MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定心肌超氧化物歧化酶活力。

1.6血浆AngiotensinⅡ水平测定

取动脉血4mL，注入抗凝管中，4℃3000 r/min离心，分离血浆，采用放射免疫法检测血浆AngiotensinⅡ水平。

1.7统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用X2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1心肌组织切片染色结果

正常对照组肌纤维完整，心肌细胞形态规则，间质未见血管扩张。模型组心肌纤维排列不规则，疏松，结构紊乱，大范围肿胀、断裂，间质血管明显扩张及大量炎症细胞浸润。参附注射液高剂量组肌纤维肿胀减轻，空隙略增宽，偶有炎症细胞浸润。见图1。

2.2心肌细胞超微结构变化

正常对照组大鼠心肌细胞肌丝排列整齐，肌节明暗带清晰。与正常对照组比较，模型组大鼠心肌细胞肌丝排列疏松、紊乱，大部分肌丝呈断裂溶解状。高剂量组大鼠心肌细胞可见肌丝排列整齐，少数肌丝溶解，肌节明暗带清晰。见图2。

图1　光镜下大鼠心肌病理形态学变化（HE，2 0 0×）

图2　电镜下各组大鼠心肌细胞的超微结构变化（1 5 0 0 0×）

2.3参附注射液对大鼠LVM I含量的影响

与模型组比较，参附注射液各剂量组大鼠LVMI含量差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4参附注射液对大鼠心肌SOD活性和MDA含量的影响

与正常对照组比较，模型组心肌SOD活性明显降低（P＜0.01），给予不同剂量参附注射液处理后，心肌SOD活性明显高于模型组（P＜0.01）；模型组MDA含量明显高于正常对照组（P＜0.01），参附注射液高、中、低剂量MDA含量明显低于模型组（P＜0.01）。其中参附注射液高剂量组MDA含量降低最多。见表2。

表1　参附注射液对大鼠L VM I含量的影响（±s）

表1　参附注射液对大鼠L VM I含量的影响（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；LVMI：左室重量指数；LVW：左室质量

组别　　动物数　体重（g）　LVW（mg）　LVMI（译）正常对照组模型组卡托普利组参附注射液低剂量组参附注射液中剂量组参附注射液高剂量组15 15 15 15 15 15 268.32±12.34 220.35±11.86 245.26±10.21 232.33±13.23 242.02±11.01 249.44±10.02 420.52±48.65 513.69±52.34 470.27±45.68 501.28±55.25 483.36±45.62 471.25±50.24 1.57±0.22 2.33±0.12*1.91±0.14△2.16±0.13△2.00±0.11△1.89±0.15△

表2　参附注射液对大鼠心肌SOD活性和MDA含量的影响（±s）

表2　参附注射液对大鼠心肌SOD活性和MDA含量的影响（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

组别　　动物数　SOD（U/L）　MDA（nmol/mg）正常对照组模型组卡托普利组参附注射液低剂量组参附注射液中剂量组参附注射液高剂量组15 15 15 15 15 15 140.21±10.45 76.35±6.32*115.26±7.21△102.33±8.23△110.02±6.01△128.44±10.02△7.96±0.88 11.84±1.05*8.82±0.16△10.52±0.32△9.05±0.44△8.48±0.28△

2.5参附注射液对大鼠AngiotensinⅡ水平的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血清AngiotensinⅡ水平显著升高（P＜0.01）。参附注射液各剂量组和卡托普利组经处理后，AngiotensinⅡ水平降低（P＜0.01）。其中参附注射液高剂量组大鼠的AngiotensinⅡ水平最低。见表3。

表3　参附注射液对大鼠血管紧张素Ⅱ水平的影响（n g/m L，±s）

表3　参附注射液对大鼠血管紧张素Ⅱ水平的影响（n g/m L，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01

组别　　动物数　　血管紧张素Ⅱ正常对照组模型组卡托普利组参附注射液低剂量组参附注射液中剂量组参附注射液高剂量组15 15 15 15 15 15 294.21±10.45 676.35±6.32*421.32±6.88△560.33±8.23△480.02±6.01△395.21±10.02△

3　讨论

ADR主要适用于急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病，其毒性作用主要表现为心律失常、心肌肥大乃至心力衰竭。ADR所致心脏毒性机制颇为复杂，目前研究认为，ADR进入心肌细胞后产生过量氧自由基，进而导致脂肪过氧化造成细胞功能损伤[8-10]。脂质过氧化反应造成能量代谢异常，从而导致心肌的收缩及舒张障碍进而出现心力衰竭。心衰时AngiotensinⅡ含量增加，AngiotensinⅡ可作用于血管平滑肌，引起细胞的增生、肥大使血管壁增厚，促进心衰过程的发展[11-12]。参附注射液主要治疗阳虚所致的各种疾病，成分主要为人参皂苷和去甲乌头碱，人参皂苷可改善心肌营养代谢，提高心肌收缩力。乌头碱则能显著提高心脏功能[13-14]。研究表明参附注射液具有显著的抗氧化作用，可清除超氧自由基，抑制羟自由基对细胞膜的破坏[15-16]。

心脏LVMI是评价左心功能不全严重程度的重要指标，本研究采用ADR造模，结果发现模型组大鼠LVMI较正常对照组显著升高（P＜0.01），同时心肌病理形态学改变明显，提示成功建立ADR心衰模型。高剂量参附注射液（4 mL/kg）与卡托普利降低心衰大鼠LVMI的作用相当（P＞0.05）。卡托普利、参附注射液给药后的心衰大鼠LVMI较模型组显著降低（P＜0.01），表明参附注射液与卡托普利均可保护心肌组织。SOD和MDA是脂肪过氧化的重要产物，SOD通过催化超氧阴离子歧化为H2O和O2，从而起到清除自由基的作用[17-19]。MDA是自由基代谢产物。本实验发现模型组血清MDA量和Ⅱ含量明显升高，心肌SOD活性下降，参附注射液各剂量组SOD活性明显高于模型组，MDA含量明显低于模型组，表明参附注射液可能通过降低血浆中MDA含量、增强SOD活性而发挥抗脂质过氧化作用起到心脏保护作用，减少心肌损伤。同时模型组Ⅱ水平明显升高，与相关研究一致[20]。阳性对照组和参附各剂量组Ⅱ水平降低，与模型组相比有明显差异。

综上所述，本实验表明参附注射液可以改善ADR心衰大鼠的心功能，机制可能与其抗氧化、降低AngiotensinⅡ含量有关。而至于AngiotensinⅡ引起的分子机制变化，需要在下一步研究中进一步探讨。

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Effects of Shenfu Injection on oxdative stress and AngiotensinⅡof rats w ith heart failure induced by Adriam ycin

ZHANG Zhigang SUN Guodong CHANGWenhua CHEN Jianzhong▲
Department of Pharmacology,Liaocheng People's Hospital,Shandong Province,Liaocheng 252000,China

[Abstract]Objective To explore the effects of Shenfu Injection on oxdative stress and angiotensinⅡof rats with heart failure induced by Adriamycin.M ethods Totally 90 rats were randomly divided into five groups with 15 rats in each group:normal control group,model control group,Captopril group(as positive control),and Shenfu Injection low,medium,high dose group.The normal control group was only treated with saline by intraperitoneal injection throughout the course of the experiment,while the other four groups were given Adriamycin by intraperitoneal injection with the total dosage of 20mg/kg.For the Shenfu Injection low,medium,high dose group,1,2,4mL/kg Shenfu Injection were given after Adriamycin Injection seven days later.For the positive control group,180mg/(kg·d)Captoprilwas given.After the model was successfully established,relevant indexes were measured.The activities of plasma superoxide dismutase (SOD)and the contents ofmalondialdehyde(MDA)in myocardial tissuesweremeasured.The levels of angiotensinⅡin serum were detected.Pathological changes in cardiomyocyte were observed.With electron microscope,the cardiac ultrastructural changes in damaged myocardium were examined.Results Adriamycin significant decreased the activities of SOD.After treatmentwith Captopril and 4 mL/kg Shenfu Injection,the activities of superoxide dismutase increased to(125.26±7.21),(128.44±10.02)U/L.There were great significances as compared with those in model group,the differenceswere statistically significant(P＜0.01).Adriamycin also increased the contents of MDA and the levels of angiotensinⅡ.After treatmentwith Captopril and 4 mL/kg Shenfu Injection,the contents of MDA in myocardial tissues decreased to(8.82±0.16),(8.48±0.28)nmol/mg.The levelsof angiotensinⅡin serum decreased to(388.32± 6.88),(395.21±10.02)ng/L,compared with those inbook=22,ebook=25model group,the differenceswere statistically significant(P＜0.01).In addition,the changes ofmyocardial pathological and ultrastructural damages were improved.Conclusion Shenfu Injection significantly improves the cardiac function of ratswith adriamycin-induced heart failure through antioxidant and reducing the angiotensinⅡlevel.

[Key words]Shenfu Injection;Adriamycin;AngiotensinⅡ;Heart failture;Superoxide dismutase

通讯作者▲

[作者简介]张志刚（1975.11-），男，硕士；研究方向：心血管药理学。

[中图分类号]R332

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2016）01（a）-0021-04