高效液相色谱法对生脉胶囊中人参皂苷Rg1和Re的含量测定

孙彩华　　付　迎　　蒋毅超.浙江中医药大学附属第一医院药剂科，浙江杭州　30004；.正大青春宝药业有限公司，浙江杭州　3003



高效液相色谱法对生脉胶囊中人参皂苷Rg1和Re的含量测定

孙彩华1付迎2蒋毅超2
1.浙江中医药大学附属第一医院药剂科，浙江杭州310004；2.正大青春宝药业有限公司，浙江杭州310023

[摘要]目的探究和分析高效液相色谱（HPLC）法对生脉胶囊中人参皂苷Rg1和Re的含量测定。方法应用HPLC法，优化色谱条件，色谱柱采用Agilent 1100 C18（5μm，4.6 mm×250mm），流动相选择乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78），检测波长是203 nm，色谱柱温度为30℃，流速1mL/min，计算回收率采用的是外标法，按峰面积计算。结果人参皂苷Rg1在0.0412～0.412μg范围内与其峰面积呈现良好线性关系（r=0.999 96），其平均回收率达97.88%（RSD=1.06%）；人参皂苷Re在0.1618～1.618μg范围内与峰面积呈现良好线性关系（r=0.999 98），平均回收率达98.21%（RSD=1.16%）。结论HPLC法操作简单、快速，所得结果准确，适用于生脉胶囊中人参皂苷Rg1和Re的含量测定。

[关键词]高效液相色谱；生脉胶囊；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；含量测定

生脉胶囊主要由人参、麦冬、五味子经科学方法精制而成，具有益气复脉、养阴生津的功效，临床上主要应用于休克、冠心病、心力衰竭等疾病的治疗[1-3]。方中人参为君药，能够大补元气、复脉固脱、生津益肺、安神益智，是生脉胶囊发挥疗效的重要组成部分。人参的主要活性成分有20多种[4]，包括人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rd等[5-6]，这些人参皂苷的含量与人参的疗效密切相关。《中国药典》（2010版）明确提出将人参皂苷Rg1与Re作为测定制剂中含有人参分量多少的指标，测定药材中人参皂苷Rg1和Re含量成为评估药品优劣及判定给药剂量的重要环节[7]。人参皂苷Rg1和Re含量的测定方法很多，包括薄层层析法、分光光度法、比色法等，近年来高效液相色谱（HPLC）法以其速度快、操作简单、结果准确等优点而被用于人参皂苷Rg1和Re含量的测定，取得了较为满意的效果[8]。本研究通过HPLC法测定人参皂苷Rg1 和Re的含量，为生脉胶囊的质量控制提供有效方法，具体报道如下：

1　仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1100系列高效液相色谱议（济南上地电子科技有限公司）包括：四元泵、真空脱气泵、柱温箱、VWD检测器，自动进样器，Agilent化学工作站；Bolong USC-502超声清洗机（济宁万和超声电子设备有限公司）；BS224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；LD5000/6S多效蒸馏水机（吉林省华通制药设备有限公司）。

1.2药物与试剂

生脉胶囊（正大青春宝药业有限公司；规格：0.3g/粒；批号：20140702、20140710、20140716）；人参皂苷Rg1对照品（中国药品生物制品检定所；批号：110703-201027，含量测定用）；人参皂苷Re对照品（中国药品生物制品检定所；批号：110754-201123，含量测定用）；甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck公司），水为注射用水，其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent1100C18（5μm，4.6mm×250mm，），柱温为30℃，将人参皂苷Rg1及Re的检测灵敏度作为考虑因素，综合判断并选择检测波长为203 nm，流速为1mL/min，流动相为乙腈-0.1%磷酸（22∶78）。理论塔板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。对照品、供试品与阴性样品的色谱图见图1。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备分别对10 g的人参皂苷Rg1对照品、10 g人参皂苷Re对照品进行精密的测量，后将其放置于10 mL容量瓶中，向其中加入甲醇使上述Rg1及Re对照品得到充分的溶解与摇匀。同样，给予精密测量1.0mL的对照品溶液置入5mL容量瓶中，向其中加入甲醇至刻度并摇匀，作为对照品溶液存放在4℃的冰箱中。

2.2.2供试品溶液的制备取30粒生脉胶囊进行研细并混匀，取其中3.0 g左右给予精密称定，将其放置于具塞锥形瓶中，向其中加入25mL的70%乙醇溶液后给予密塞，常规进行0.5 h的超声处理，将超声功率及频率分别设置在250W、50 kHz，滤过处理（必要时先离心再滤过）。采用20mL的70%乙醇溶液对容器及滤器进行清洗，蒸干后向残渣中加水20mL帮助其溶解，采用水饱和的正丁醇振摇提取5次，第1次剂量为20mL，第2次剂量为20mL，第3次剂量为20mL，第4次剂量为15 mL，第5次剂量为15 mL，合并正丁醇提取液，放置在水浴上蒸干，向残渣中加入适当的甲醇适量促进溶解，后将其转移至10mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度后摇匀。对该溶液使用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，将其作为供试品溶液存放在4℃的冰箱中保存。

2.2.3阴性样品溶液的制备按生脉胶囊处方组成取除去人参药材外的药材和辅料，按生脉胶囊的制备工艺和供试品溶液的制备制成阴性对照溶液。2.3线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液（人参皂苷Rg1和Re），吸取的剂量分别为1、5、10、15、20、25、30μL注入到液相色谱仪中。按“2.1”项下色谱条件进行分析并对峰面积进行测定。分别以峰面积、对照品溶液含量作为纵坐标及横坐标，绘制成标准曲线后给予回归计算。计算所得回归方程，人参皂苷Rg1：Y= 4615.25 X-126.31（r=0.999 96），结果提示，人参皂苷Rg1在0.0412～0.412μg之间具有良好的线性关系。结果得人参皂苷Re的回归方程Y=3906.13 X-225.62 （r=0.999 98），提示人参皂苷Re在0.1618～1.618μg之间具有良好的线性关系。

图1　对照品、供试品与阴性样品的色谱

2.4方法学考查

2.4.1精密度试验取批号为20140710生脉胶囊的样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件注入高效液相色谱仪连续进样6次，每次10μL，依法测定。计算人参皂苷Rg1峰面积的RSD 为1.20%；人参皂苷Re峰面积的RSD为1.03%，表明精密度良好。

2.4.2稳定性试验取该生脉胶囊的同一批供试品（批号：20140710），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8 h进样10μL，测定峰面积，计算人参皂苷Rg1峰面积的RSD为1.65%；人参皂苷Re峰面积的RSD为1.74%，表明供试品溶液在8 h内稳定。2.4.3重复性试验选取同一批供试品该生脉胶囊（批号：20140710），一共6份，完全按照按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并在相同的色谱条件下测定，后准确计算人参皂苷Rg1及Re的质量分数。结果提示，在样品中人参皂苷Rg1平均含量为0.6859mg/mL，RSD 为1.10%；人参皂苷Re平均含量为0.2605mg/mL，RSD 为1.23%（n=6）。结果表明本方法重复性良好。

2.4.4加样回收率试验取该生脉胶囊的同一批供试品（批号：20140710）适量，研细，精密称取粉末6份，每份约1.50 g，精密称定，分别精密加入人参皂苷Rg1对照品和人参皂苷Re对照品，按“2.2.2”项下方法制得加样回收试验的供试品溶液，每次进样10μL，按上述色谱条件测定，计算回收率，取平均值，人参皂苷Rg1的平均加样回收率为97.88%，人参皂苷Re的平均加样回收率为98.21%。见表1。

表1　人参皂苷R g 1和R e加样回收率试验结果（n=6）

2.5样品的测定

分别选取该生脉胶囊的3批样品（批号分别为20140702、20140710、20140716），按照上述方法给予精密称定，同时按照上述“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液，按外标法计量样品中人参皂苷Rg1和Re的含量，结果见表2。

表2　生脉胶囊中人参皂苷R g 1和R e含量测定结果（n=3）

3　讨论

3.1色谱柱的选择

有资料证实，HPLC法的色谱柱越长，所需要的流速就越大，使用的流动相的量就越多，这样色谱柱就越高，因此，选择短的色谱柱较为合理[9]。而笔者分析以15 cm和25 cm长度的色谱柱进行分离，结果两种长度的色谱柱均能分离样品中人参皂苷Rg1和Re，且都达到了1.5倍以上的分离度[10]。鉴于两种长度色谱柱都达到了想要的分离效果，笔者认为长度为15 cm的色谱柱更为合适。

3.2提取方法的选择

笔者先查阅了文献及药典，并先后尝试采用萃取法、大孔吸附树脂柱、中性氧化铝柱或大孔吸附树脂柱与中性氧化铝柱共同参与等各种要求下的层析法提取生脉胶囊中的人参皂苷Rg1和Re，相比之下，对人参皂苷Rg1和Re的选择性较高且干扰性小的方法是萃取法，且萃取法专属性好，研究员认为萃取法制备供试品所达到的效果更为满意。

3.3流对相的选择

为了达到人参皂苷Rg1和Re检测要求，需要减少液相色谱仪检测的干扰杂质，所以脱脂所用溶液的选择同样重要，笔者对比了应用三氯甲烷、乙醚以及三氯甲烷和乙醚按照9∶1、3∶1、2∶1、1∶1比例组合后的溶液进行提取脱脂，结果发现三氯甲烷与乙醚按照3∶1比例混合的溶液进行提取脱脂后在液相色谱仪检测到的干扰成分是这些成分中最少的，用此比例脱脂非常合适[11-12]。

3.4流动相及柱温的选择

笔者曾选用《中国药典》2010年版（一部）人参含量测定项下所用乙腈-水的洗脱方法，但谱峰拖尾较严重，分离效果不理想。后采用文献报道的乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸为流动相，发现以乙腈-0.1%磷酸（22∶78）作为流动相，对样品的分离较好[13]。进一步摸索发现流动相中乙腈浓度变化对人参皂苷Rg1和Re分离度的影响不容忽视，如果乙腈的浓度在19%（0～35 min）能使人参皂苷Rg1和Re的分离度达到1.5倍以上，但是存在干扰峰，若将乙腈设定为19%～28%（35～50 min）时，避免干扰峰的影响，人参皂苷Rg1和Re的分离度也相应提高[14-15]。笔者在此基础上，对柱温进行考察，分别将柱温设置在20、25、30℃，进行检测后发现柱温为30℃时液相色谱仪的分离度明显比20℃和25℃时所得的结果要好，所以30℃为较合适的色谱柱温度。

本研究选择生脉胶囊为供试品的原材料，生脉胶囊中所含人参对于其药效的发挥起着重要作用，人参发挥药理作用主要是因为含有活性成分——人参皂苷[16]。人参皂苷是固醇类化合物，关于人参皂苷的提取分离方法是近年来相对研究较多的一个领域[17]。HPLC法作为新型的检测物质成分的方法，已经被广泛应用和开展，HPLC法的灵敏度高、测量结果准确，并且具有操作简单、检测速度快的优点[18-19]。本研究通过多次试验优化了HPLC法的条件，在色谱柱、流动相、柱温、提取方法等工艺发面进行多次的尝试并选择最优的条件，对人参皂苷Rg1和Re含量的测定取得了良好的效果，总结研究所得的成果，HPLC法以其多个优势而用于测定人参皂苷Rg1和Re的含量，供生产工艺改造和质量标准的制订作出参考。

对本研究中存在的不足进行分析，HPLC法在人参皂苷Rg1和Re的测量中已经达到了很高的分离标准，提高了检测的精确性，但是，HPLC法操作过程所用仪器的成本较高，昂贵的价格限制了它在一些地区的应用，其在各地普及还需要一定的时间和经济条件。近年来以HPLC法为基础，已经出现液-质联用高效液相色谱（HPLC-MS/MS）法、超高效液相色谱（UPLC）法等新技术，这些新方法同样用于有效成分的测量，液-质联用高效液相色谱（HPLC-MS/MS）法能够同时测量人工皂苷Rg1和Re的检测，超高效液相色谱法则比高效液相色谱法的检测灵敏度更高、检测速度更快、操作也更为简单，不失为人参皂苷Rg1 和Re的更好办法，超高效液相色谱法值得我们做进一步的探讨[20-23]。本研究只针对人参中人参皂苷Rg1 和Re两种活性成分进行测定，而其主要活性成分有20多种，有关人参中其他类型人工皂苷含量的检测方法也有文献记载，但是有些种类的检测技术还在研究探索阶段，后续可以对人参中其他活性成分的检测做进一步的研究。

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Determ ination of Ginsenoside Rg1 and Ginsenoside Re in Shengmai Capsules by HPLC

SUN Caihua1FU Ying2JIANG Yichao2
1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang Province, Hangzhou310004,China;2.Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co.Ltd.,Zhejiang Province,Hangzhou310023, China

[Abstract]Objective To develop a HPLCmethod for determination of ginsenosides Rg1&Re from Shengmai Capsule. M ethods The separation was performed on Agilent 1100 C18(5μm,4.6 mm×250 mm)column eluted with themobile phase consisting of acetonitrile and-0.1%phosphoric acid solution(22∶78)at the flow rate of 1mL/min.The detection wavelength was 203 nm and the column temperature was 30℃,extemal standard method was used tomeasure recovery according to the peak area calculution.Results Ginsenoside Rg1 had a good linear relationship with the peak area within 0.0412-0.412μg(r=0.999 96),the average recovery was 97.88%(RSD=1.06%);Ginsenoside Re had a good linear relation with the peak area within 0.1618-1.618μg(r=0.999 98),the average recovery was 98.21%(RSD= 1.16%).Conclusion The HPLCmethod is simple,rapid and accurate,which is suitable for the determination of Ginsenoside Rg1&Re from Shengmai Capsule.

[Key words]High performance liquid chromatography;Shengmai Capsules;Ginsenosides Rg1;Ginsenoside Re;Determination

收稿日期：（2015-09-18本文编辑：赵鲁枫）

[作者简介]孙彩华（1974-），男，浙江中医药大学2013级中药学专业在读硕士研究生，副主任中药师；主攻方向：药物鉴定与临床药学。

[基金项目]浙江省中医药科技立项课题（2015ZB045）。

[中图分类号]R927.2

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2016）01（a）-0009-04