急性期兔前交叉韧带保残重建的组织学研究

黎广平　　陈大福▲　　刘宝岳.北京积水潭医院北京市创伤骨科研究所，北京　00035；.北京积水潭医院病理科，北京　00035



急性期兔前交叉韧带保残重建的组织学研究

黎广平1陈大福1▲刘宝岳2
1.北京积水潭医院北京市创伤骨科研究所，北京100035；2.北京积水潭医院病理科，北京100035

[摘要]目的应用动物模型评估急性期保留残端对兔前交叉韧带（ACL）重建的组织学意义。方法选取20只成年健康的新西兰兔，利用其一侧后肢塑造急性期ACL断裂模型，然后将所有动物随机分为两组，每组各10只。一组采用保留残存腱束的方法重建ACL（保残组）,另一组采用去除残存腱束的方法重建ACL（去残组）。所有动物统一采用自体半腱肌腱作为移植物，并在术后12周统一处死。首先利用肉眼对韧带的宏观状态进行观察，然后利用HE染色评估残端与移植物愈合情况，并利用免疫组化染色评估移植物本体感受器及血运重建恢复情况。结果大体观察结果显示，所有ACL移植物连续性完整，张力满意。HE染色评估显示残端及移植物未见明显愈合迹象。免疫组化结果显示两组标本移植物本体感受器数量（P=0.564）及新生血管数量（P=0.783）差异无统计学意义。结论急性期保残重建ACL未能显著提高兔ACL重建的组织学性能。本研究中，组织学评估显示ACL残端与移植物间未能愈合，且两组移植物中新生神经本体感受器与新生血管数量未见显著差异。因此，保留残端重建ACL的组织学意义令人质疑。

[关键词]前交叉韧带；保留残端；组织学；兔

前交叉韧带（anterior circulate ligament，ACL）重建的手术技术目前虽已成熟，但仍有文献报道称目前ACL损伤重建的失效率约为20%[1-4]。由此看来，该手术仍可被优化。近年来，许多学者提出ACL损伤通常发生在其股骨止点附近，并在损伤后一段时间内留有一定长度的残端[5-7]。与此同时，相关的基础研究也已证实：在ACL残端内部能够观察到血管及神经本体感受器的存在[8-13]。因此，有学者提出，在传统的韧带重建基础上保留这些残端，有可能促进移植物的再血管化，进而改善患者术后膝关节本体感觉的恢复[6-7]。另一方面，也有研究显示，ACL残端内部的血管及神经本体感受器只能在ACL损伤后的急性期内观察到，其数量会随着损伤时间的延长而下降[14]。由此，急性期保留残端的理念又引起了学术界的关注。回顾既往文献发现，有关保留残端ACL重建的相关研究主要呈现出以下两方面的特点：①目前尚无临床或基础研究针对性评估ACL保残术后移植物血运重建及神经本体感觉的恢复情况；②大部分临床研究皆为回顾性或非对照研究，保留残端重建ACL的临床依据尚不明确。因此，本研究塑造了ACL急性期损伤重建的动物模型，目的是利用动物模型评估急性期保留残端对ACL重建术后移植物的组织学意义。

1　材料与方法

1.1实验动物

采用成年健康新西兰大白兔20只，体重3.0～3.8 kg，平均（3.5±0.1）kg。动物合格证号：SCXK（京）2011-0006。随机分为两组，每组各10只。一组行保留残端ACL重建术（保残组），另一组行去除残端ACL重建术（去残组）。所有手术均为单侧ACL重建，手术侧别随机选择，且统一采用自体半腱肌腱作为移植物。术后12周时将动物全部处死取材，对所取标本分别行大体观察及组织学评估。

1.2急性期ACL损伤模型的建立

所有动物均行单侧ACL重建术，手术侧别均在术前随机决定。备皮完毕后，利用无菌绷带包扎手术侧足跟部，然后常规消毒，铺单，麻醉。首先在髌骨内侧缘附近做一长4～5 cm纵行切口，使髌骨向外脱位，充分暴露正常ACL组织。然后紧贴ACL股骨止点利用手术刀将正常ACL组织切断，并保留ACL实质部及胫骨止点的完整性。至此，急性期ACL损伤模型建立完毕。

1.3手术方法

本研究所采用的保留残存腱束的手术方法与宋关阳等[15]的手术方法相同，具体步骤描述如下：

1.3.1保残组处理ACL残端：利用4-0不可吸收的涤纶线在残存腱束的股骨末端滑膜完整处缝合3～4针，用以牵拉腱束组织。

制备胫骨隧道：胫骨隧道利用直径2.0 mm克氏针钻取。为了不破坏残端组织，隧道中心点定位于ACL残端胫骨止点后方约1.0mm处，采用由内向外的方法钻取胫骨隧道。

制备股骨隧道：利用另外一根2.0mm的克氏针制备股骨隧道。隧道中心点位于ACL股骨足印区的中心点，同样采用由内向外的方法钻取。

获取与制备移植物：本研究从手术侧获取自体半腱肌腱移植物。接下来，使用4-0涤纶线编织缝合移植物两端，并分别测量其长度及直径。

固定移植物及残端：在导针的牵引下，先将移植物从胫骨隧道引入，再将其与残端牵引线同时引入股骨隧道。随后利用Endobutton装置固定股骨侧，固定时施以一定张力，使移植物及ACL残端均能进入股骨隧道。然后利用Endobutton装置固定移植物胫骨侧。最后在关节内靠近股骨隧道内口处将残端与移植物利用可吸收缝线缝合一针，以促进二者纤维之间的相互长入。

1.3.2去残组对于去残组动物，则采用相同的方法制备股骨隧道。在制备胫骨隧道时，先将ACL残端完全去除，然后充分显露其胫骨足印区，并选择足印区中心点钻取胫骨隧道。最终同样采用Endobutton固定移植物两端。术后所有动物统一笼养，自由活动。

1.4标本制备

术后12周，将所有动物统一处死，取动物的双侧下肢（从髋关节处离断）。然后小心去除膝关节囊周围的肌肉及软组织，并将标本用生理盐水纱布包扎，在-4℃条件下冷冻，在实验前1 d将标本置于4℃环境中解冻。

1.5大体观察

首先观察手术侧关节大体形态，包括关节活动度（range ofmotion，ROM）、关节感染状况以及关节内部结构（包括关节软骨、双侧半月板），然后观察移植物连续性及其张力（每组各10个）。

1.6组织学评估

取每组标本分别进行HE染色及免疫组化染色评估。首先切断除ACL移植物及残端组织以外的所有韧带，并去除双侧半月板及膝关节周围软组织。然后以膝关节为中心，分别在股骨近端及胫骨远端1 cm处将标本横断，得到股骨-移植物/残端-胫骨复合体，并在室温条件下将复合体置于4%福尔马林固定液中固定48 h。接下来先后经过脱钙、冲洗和石蜡包埋三步处理方法将标本完全包埋于蜡块之中，并在切片机上沿移植物/残端走行方向以4μm为厚度进行切片。每个标本连续切片共5张，最终采用HE染色方法对标本进行组织学评估。评估内容包括两个方面：①移植物的腱骨愈合状况；②ACL残端与移植物之间的愈合情况。

然后分别利用两种单克隆一抗血管内皮生长因子（endothelial vascular growth factor，VEGF）与神经纤丝（Neurofilament，NF）两种第一抗体进行染色，然后经过相关洗涤及抗原孵化过程后，利用相应第二抗体进行染色，最后在光学显微镜下观察染色结果，对每个标本的每个层面随机抽取5个感兴趣区域，并利用光学处理软件Image-Pro Plus统计最终的阳性结果数量.

1.7统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用X2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组动物的术前相关数据比较

术前保残组与去残组的动物质量、移植物长度及横截面直径的比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1　两组动物的术前相关数据比较（±s）

表1　两组动物的术前相关数据比较（±s）

组别　动物数　　体重（kg）自体肌腱长度（cm）自体肌腱横截面直径（mm）保残组去残组P值10 10 3.54±0.23 3.63±0.29 0.853 1.65±0.04 1.67±0.07 0.674 1.64±0.05 1.66±0.08 0.268

2.2术后大体观察

术后12周行大体观察时，保残组与去残组标本ROM与正常侧比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，所有手术侧关节标本均未发现明显骨关节炎的表现，且双侧半月板均未见撕裂，所有ACL移植物均具有完整的连续性及满意的张力。见图1。

2.3术后组织学评估

保残组与去残组标本经HE染色后显微镜下观察显示移植物胫骨侧和股骨侧两端隧道内部腱骨愈合情况良好，且移植物内部纤维细胞呈均匀纵行排列。进一步观察保残组标本ACL残端与移植物愈合情况时，可见残端组织与移植物之间在胫骨侧、韧带实质部与股骨侧均存在明显间隙，并未发现任何纤维融合表现，由此可见残端与移植物间并未出现显著愈合迹象。见图2。

两组标本免疫组化染色结果显示ACL移植物内部VEGF阳性新生血管数量与NF新生阳性本体感受器数量差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3～4、表2。

图3　两组血管内皮生长因子阳性血管数量（1 0 0×）

图4　神经纤丝阳性本体感受器数量镜下图像（1 0 0×）

表2　两组术后血管内皮生长因子阳性血管及神经纤丝阳性本体感受器数量（±s）

表2　两组术后血管内皮生长因子阳性血管及神经纤丝阳性本体感受器数量（±s）

组别　　动物数　血管内皮生长因子阳性血管数量神经纤丝阳性本体感受器数量保残组去残组P值10 10 28.3±4.2 27.6±5.1 0.564 30.5±5.3 29.8±6.4 0.783

3　讨论

本研究最主要的发现：急性期保留残端技术相比去除残端重建ACL技术未能显著改善ACL移植物的血运重建及神经本体感觉的恢复状况。

回顾既往文献发现，目前关于保残重建ACL是否能够显著提高术后膝关节本体感觉在学术界尚存争议。虽然Ahn等[13]的结果显示保残重建ACL术后2年患者的膝关节本体感觉恢复良好，但Hong等[7]最近的随机对照研究则显示保残组患者与去残组相比其术后2年膝关节本体感觉并没有显著性差异。本研究组认为，保留残端技术究竟能否明显改善术后膝关节本体感觉，应首先基于残端组织是否能够和移植物愈合成为一体。另一方面，也有一些作者提倡急性期保留残端重建ACL的理念[14-16]。Denti等[14]发现ACL完全断裂后，其残端内部的本体感受器会随着损伤时间的延长而下降；Ahn等[5]利用核磁影像评估保残术后患者的残端愈合情况时也发现，凡是受伤到手术时间越短的患者，其保残术后残端与移植物的愈合情况越满意。因此，本研究所有保残手术均在ACL损伤的急性期进行，希望能够显著提高残端存活率以及改善与移植物的愈合效果。

然而，本研究通过对残端HE染色的进一步观察发现：残端组织与移植物之间仍存明显间隙，二者并未出现愈合迹象。该结果与既往研究结果似乎有显著不同：Ahn等[5]利用核磁评估保残术后残端与移植物间的愈合情况，结果显示85%的患者其残端信号已难与移植物区分；而之后的二次关节镜探查[15]也显示有82%的患者残端与移植物愈合状况满意。但核磁本身并不能作为评价残端愈合情况的“金标准”，而且Ahn 等[5]的二次关节镜探查只能称之为大体观察，并未针对残端的愈合状况做进一步评估。

基于此，本研究利用组织学切片的方法进一步评估残端与移植物之间的愈合情况，结果显示ACL残端组织与移植物间仍然存在显著间隙。一方面，组织学染色相比核磁评估与二次关节镜探查而言，评估方法更为准确可靠，可以作为目前评估残端组织与移植物愈合情况的“金标准”；另一方面，本研究首先应用病理学方法评估残端组织的愈合效果，可以为今后的相关研究提供一定的参考价值。

本研究存在如下几个方面的不足：①本研究为动物实验，从动物研究中获得的数据并不能直接应用于临床；②动物与人的ACL术后恢复周期存在较大差异，本研究组之所以选择12周作为实验终末点，是因为已有文献报道[17-18]术后12周兔ACL的腱骨愈合程度已趋于成熟。

急性期保残重建ACL未能显著提高兔ACL重建的组织学性能。本研究中，组织学评估显示ACL残端与移植物间未能愈合，且两组移植物中新生神经本体感受器与新生血管数量未见显著差异。因此，保留残端重建ACL的组织学意义令人质疑。

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Histological study of acute anterior cruciate ligament reconstruction w ith remnant preservation in rabbits

LIGuangping1CHEN Dafu1▲LIU Baoyue2
1.Beijing Institute of Traumatology&Orthopaedics,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China;2.Department of Pathology,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China

[Abstract]Objective To evaluate the potential histological benefits after the acute remnant-preserving anterior cruciate ligament(ACL)reconstruction in rabbitmodel.M ethods 20mature female New Zealand white rabbitswere selected for acute ACL femoral detachmentmodel in one of the hind limbs,they were randomly divided into two groups,with 10 rabbits in each group.Remnant-preserving group were treated with remnant-preserving ACL reconstruction,conventional remnant group were treated with conventional ACL reconstruction.All the surgeries used the semitendinosus tendon autografts,and all the animals were sacrificed at 12 weeks after surgery for macroscopic observations.The remnant-to-graft healing capacity was evaluated using HE stainingmethod,the immonuhistochemical staining was used to assess the reinnervation and revascularity of the ACL grafts between groups.Results Macroscopic observations revealed that all the ACL graftsmaintained adequate continuity and tension.Histological evaluations showed that satisfied tendon-to-bone healing results in each specimen.However,none of the specimen showed a remnant-to-graft healing results.Moreover,the reinnervation(P=0.564)and revascularity(P=0.783)of ACL grafts still showed no statistically significant differences between two groups.Conclusion The acute remnant-preserving ACL reconstruction fail to significantly improve the histological properties compared with the conventional ACL reconstruction.In this study,no remnant-to-graft healing capacity shows on HE staining and no significant differences detecte between groups in terms of reinnervation and revascularity of the ACL grafts.The histological benefit of remnant-preserving ACL reconstruction is therefore questioned.

[Key words]Anterior cruciate ligament;Remnant preservation;Histological;Rabbits

收稿日期：（2015-07-30本文编辑：苏畅）

通讯作者▲

[中图分类号]R318.01

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2016）01（a）-0030-05