耐碳青霉烯酶类抗生素鲍曼不动杆菌的同源性及其对亚胺培南的耐药机制

郭湘，费樱

（1贵州医科大学，贵阳550004；2贵州医科大学附属医院）

耐碳青霉烯酶类抗生素鲍曼不动杆菌的同源性及其对亚胺培南的耐药机制

郭湘1，费樱2

（1贵州医科大学，贵阳550004；2贵州医科大学附属医院）

目的 探讨耐碳青霉烯酶类抗生素鲍曼不动杆菌（AB）的同源性及其对亚胺培南的耐药机制。方法用扩增性核糖体DNA限制性酶切片段分析法（ARDRA）对临床收集的140株AB进行分子分型，用肠杆菌科重复基因保守序列PCR（ERIC-PCR）对确定为AB的菌株进行同源性分析，用荧光定量PCR法检测20株耐药菌株和20株敏感菌株外膜蛋白CarO和外排泵基因AdeB mRNA表达。结果 140株菌株经ARDRA鉴定为AB的130株。90株AB经ERIC-PCR法分为6个型别，主要为A型（65株）、B型（19株），C、D、E、F型为散在株。AB耐药菌株外膜蛋白CarO mRNA相对表达量低于敏感菌株，外排泵AdeB mRNA相对表达量高于敏感菌株（P均＜0.05）。结论

分离的AB基因型以A、B两型为主，且存在部分克隆株散在传播；外膜蛋白Caro低表达、外排泵基因AdeB高表达是AB对亚胺培南耐药的重要机制。

鲍曼不动杆菌；同源性；外膜蛋白；外排泵

鲍曼不动杆菌（AB）是革兰阴性非发酵杆菌，是引起临床感染的重要条件致病菌之一［1，2］，已成为院内感染的主要病原菌之一，在非发酵菌的感染中仅次于假单胞菌［3］，并且容易引起暴发流行。近年来随着抗菌药物的广泛使用，临床分离得到的AB耐药性越来越严重［4］。有研究显示，外膜蛋白Caro是亚胺培南进入细菌的孔道，与外排泵一起介导AB对亚胺培南的耐药［5，6］。本研究探讨耐碳青霉烯酶

类抗生素AB的同源性及其耐药机制。

1　材料与方法

1.1细菌、试剂及仪器 2011年7月～2012年8月收集贵州医科大学附属医院临床各科室分离的对亚胺培南耐药的非重复AB 100株，经自动化细菌鉴定仪鉴定，用于ERIC-PCR同源性分析；收集本院临床各科室分离的对亚胺培南耐药和敏感的AB各20株非重复AB，药敏结果经美国临床和实验室标准协会的细菌最低抑菌圈浓度（MIC）判定标准判定，用于荧光定量PCR检测。细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、10×PCR Buffer、DNA Marker、琼脂糖、5×TBE、EB溶液、限制性内切酶、TRIzol试剂盒、TaKaRa逆转录试剂盒、SYBR Premix EX TaqⅡ荧光定量PCR试剂盒均购于宝生物（大连）工程有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增仪GeneAmp PCR system 9700（美国PE公司）、DNA成像分析仪Gel Doc EQ（BIO-RAD公司）、DYY-Ⅲ2型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）、Light Cycler 480荧光定量PCR仪（Rocher公司）。

1.2AB分子分型鉴定 采用扩增性核糖体DNA限制性酶切片段分析法（ARDRA）。使用细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取细菌的基因组DNA。细菌基因组DNA扩增，反应体系总体积为25 μL：ddH2O 8 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物（10 μmmoL／L）各1.5 μL、Premix ExTaq 12 μL。PCR扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环后，72℃延伸7 min；ARDRA引物序列F：5′-TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGC-3′，5′-TACCTTGTTACGACTTCACCCCA-3′。将PCR产物分别用Cfo I、Alu I、Mbo I、Rsa I和Msp I 5种限制性内切酶进行酶切、电泳、扫描成像分析。每种限制性内切酶根据所切片段大小不同可分成不同的型别，5种内切酶型5个数字的排列组合代表不动杆菌不同基因型，如：11121、11123或11121+3。

1.3AB同源性检测 采用肠杆菌科重复基因保守序列PCR法（ERIC-PCR）。取ARDRA鉴定为11123型和11121+3型的90株确定为AB的菌株，引物序列：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，PCR反应体系25 μL：ddH2O 8 μL、模板DNA 2 μL、引物1 μL、Premix ExTaq 12 μL。PCR反应条件：95℃5 min，94℃45 s，55℃50 s，72℃2 min，30个循环，72℃延伸10 min。电泳、扫描成像分析。电泳条带数目和位置相同的为同一基因型别。

1.4AB外膜蛋白CarO和外排泵基因AdeB mRNA表达检测 采用荧光定量PCR法。取20株耐药菌株、20株敏感菌株，用TRIzol试剂提取AB总RNA，测定吸光度（A）值，A260／280为1.8～2.0可用于逆转录反应。基因组DNA去除反应：5×gDNA E-raser Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、Total RNA 2.0 μL、RNase Free dH2O 5.0 μL，将上述各试剂混合后，于PCR仪上进行反应，42°C 20 min。逆转录反应：5×PrimeScript®Buffer 2 4.0 μL、PrimeScript®RT Enzyme MixⅠ1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、基因组DNA去除反应、RNase Free dH2O 4.0 μL，37° C 15 min、85°C 5 s。使用SYBR Premix EX TaqⅡ法进行荧光定量PCR。反应体系共25 μL，包括SYBR Premix EX TaqⅡ12.5 μL、模板从cDNA 2.0 μL、上下游引物各1.0 μL、RNase Free dH2O 8.5 μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃5 s，60℃30 s，循环40次，每个样本重复3次。Caro引物序列F：5′-GCGGCTTACCTTGATAACG-3′，R：5′-ACCGCAATAAAGTCTTGGT-3′；AdeB引序列物F：5′-AATGCGTGAAATGGAACAACTG-3′；R：5′-TGTGATTCAGACTGCTTTTCCTG-3′；rpoB引物序列F：5′-GATGGCTGGTCGTCACGG-3′，R：5′-GATGGTACACCCAGCGGG-3′，由rpoB作为内参基因，根据2-ΔΔCt公式计算Caro、AdeB mRNA相对表达量，其中ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因。

1.5统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。计量资料用±s表示，比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1AB分子分型 用于ERIC-PCR同源性分析的100株菌株，90株确定为AB，10株由于酶切条带不清晰或者没有条带无法判断。用于实时荧光定量PCR检测的40株菌株确定均为AB。

2.2AB的同源性 经ERIC扩增后DNA片段的条带2～6条，90株鲍曼不动杆菌经ERIC-PCR基因分型，共有6个型别，分别命名为A～F型，其中A型65株，B型19株，C型2株，D型2株，E、F型各1株，C、D、E、F为散在株。

2.3AB耐药菌株、敏感菌株外膜蛋白CarO、外排泵基因AdeB mRNA表达 AB耐药菌株、敏感菌株外膜蛋白CarO mRNA相对表达量分别为0.22± 0.10、1.16±0.18，外排泵基因AdeB mRNA相对表达量分别为1.99±0.33、0.50±0.26，外膜蛋白CarO、外排泵基因AdeB mRNA相对表达量比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

3　讨论

对于不动杆菌属的鉴定，多数临床实验室采用的是自动化细菌鉴定仪，但是细菌鉴定仪Phoenix和Vitek2 Compact鉴定到种的准确率分别只有44%、56%［7］，准确率不高。因此在做AB的同源性分析以及耐药机制的研究前，使用ARDAR先对临床收集的标本进行了分子分型，从而保证了同源性分析及耐药机制研究结果的可靠性。脉冲场凝胶电泳（PFGE）是细菌分型的金标准，准确率高，但是设备条件要求高，因此本试验采用ERIC-PCR对AB进行同源性分析。有研究显示，运用ERIC-PCR与PFGE同时检测48株铜绿假单胞菌同源性，结果发现两种方法学结果的符合率为89.5%，PFGE重复3次结果相似度达96.6%，ERIC-PCR重复5次结果相似度达75.4%［8］。说明本研究采用的ERIC方法与PFGE结果一致性高，并且ERIC-PCR具有简便、快速、重复性好、稳定性高等特点，是较为理想的用于分子流行病学调查的方法［9］。有研究表明，AB主要分布在ICU、神经外科、呼吸内科［10，11］，克隆株在病房内以及在病房间的克隆播散是造成耐药菌株不断增加的主要原因［12，13］。对AB进行同源性分析有助于从分子水平上明确耐药菌株的传播来源，从而有针对性地采取控制措施，有助于有效控制耐碳青霉烯酶类AB的播散流行。ERIC-PCR基因分型结果显示主要为A、B两型，其他型别为散发株，由此可见A、B型耐药克隆株的传播已经成为本院AB对碳青霉烯抗菌药物耐药率升高的重要原因。

AB与碳青霉烯类抗生素耐药相关的外膜蛋白是CarO［14］，由CarO基因编码。不动杆菌对亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗生素的耐药与CarO丢失或表达下降有关，随着ABCarO表达下降或丢失，菌株对碳青霉烯类抗生素的通透性下降，药物不能顺利进入菌体内发挥作用而产生耐药［15］。荧光定量PCR结果显示，碳青霉烯酶类抗生素耐药组的外膜蛋白CarO基因的表达量低于敏感组的表达量，差异有统计学意义，说明外膜蛋白CarO的缺失或表达降低在AB对碳青霉烯酶类抗生素的耐药中起重要作用。外排泵系统位于细菌细胞膜上，是一类具有转运功能的蛋白质。在细菌基础代谢过程中，蛋白质和酶的转运一般都具有高度的特异性，但外排泵系统却可以识别广泛的结构和化学成分不同的底物。外排泵系统可以主动泵出进入菌体的抗菌药物，使细菌胞内有效药物浓度减少而耐药。荧光定量PCR结果显示，碳青霉烯酶类抗生素耐药组的外排泵AdeB基因的表达量高于敏感组的表达量，差异有有统计学意义，说明AB对碳青霉烯酶类抗生素的耐药与外排泵AdeB的高度表达有关。本研究只是初步探讨了外膜蛋白CarO和外排泵AdeB与AB耐药的关系，而对其具体作用原理进行探讨，是未来研究的方向。

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Homology analysis and multidrug resistance mechanisms of carbapenem-resistant Acihetobacter baumanii

GUO Xiang1，FEI Ying

（1 Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

Objective To evaluate the homology of resistance to carbapenems of Acinetobacter baumannii（AB）and its resistance mechanism to imipenem.Methods The molecular classification was conducted in 140 strains of AB from clinical collection by using amplified ribosomal DNA restriction enzyme analysis（ARDRA），enterobacteriaceae repeat gene conserved sequence-PCR（ERIC-PCR）is applied to do the homology analysis of drug resistance of 90 strains of AB.The outer membrane protein CarO and efflux pump gene AdeB mRNA expression was detected in 20 strains of resistant strains and 20 strains of sensitive strains by fluorescence quantitative PCR.Results Totally 130 strains were identified as AB by ARDRA in 140 strains.After ERIC-PCR genotyping，90 strains of AB were divided into 6 types，mainly for type A（65 strains），type B（19 strains），type C，D，F and E（which were scattered in the strains）.The outer membrane protein CarO mRNA expression in the AB with drug-resistant strains was lower than that of the sensitive strains，while the efflux pump AdeB mRNA expression was higher（all P＜0.05）.Conclusions Type A and type B were mainly found in AB genotypes and there were scattered transmission of clone strains with resistance gene.The low expression of outer membrane protein Caro and high expression of efflux pump gene AdeB was the important mechanism of AB resistance to imipenem.

Acinetobacter baumannii；homology；outer membrane protein；efflux pump

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.007

R378

A

1002-266X（2016）21-0019-03

贵州省科技攻关计划（黔科合SY字［2012］3147号）。

郭湘（1989-），男，在读硕士，主要研究方向为细菌的耐药机制。E-mail：770308473＠qq.com

简介：费樱（1968-），女，主任技师，本科，主要研究方向为细菌的耐药机制。E-mail：645903661＠qq.com

（2016-02-26）